Polissacarídeos de microalgas : estudo da capacidade de modulação de bactérias colonizadoras do trato gastrointestinal in vitro

Abstract

Resumo: Microalgas são seres unicelulares e encontram-se amplamente distribuídos na natureza. Esses organimos são considerados boas fontes de compostos bioativos devido a sua composição química diversa e serem cultiváveis em larga escala. As espécies utilizadas neste trabalho foram as microalgas marinhas Pavlova gyrans (PG) e Pavlova lutheri (PL), pertencentes à divisão Haptophyta. Diferentes estruturas de carboidratos tem sido capazes de se ligar a bactérias enteropatogênicas, impedindo assim a adesão dos patógenos ao trato gastrointestinal (TGI) dos hospedeiros (etapa fundamental na instalação de infecção em animais e humanos). Além disso, os carboidratos também aumentam seletivamente a concentração de bactérias benéficas ao hospedeiro no TGI, atividade conhecida como prebiótica. Este trabalho teve como objetivo extrair e caracterizar a estrutura química dos polissacarídeos de Pavlova lutheri e P. gyrans, e avaliar o potencial prebiótico in vitro (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356) destes polissacarídeos, bem como sua capacidade de adesão à bactérias patogênicas (Salmonella enterica sv. Typhimurium ATCC 14028), obtendo assim um panorama geral da atividade destes polissacarídeos sobre a microbiota intestinal. Para isso, ambas as microalgas foram cultivadas em meio Guillard f/2, durante 14 dias, na sequência foram submetidas a centrifugação e liofilização para obtenção da biomassa seca. A biomassa seca de PG e PL foi submetida a extração sequencial (20 g/L) em água a 80 °C, por 2 h sob agitação magnética, centrifugada onde o resíduo foi submetido a extração alcalina (20 g/L) com NaOH 0,5 M a 80 °C, por 2 h sob agitação magnética e centrifugado, o sobrenadante foi neutralizado com HCl 0,1 M e dialisado. Ambos os sobrenadantes aquoso (AQ) e alcalino (AL) foram precipitados com 3 V de etanol, centrifugados e o pellet resuspendido em água e submetido a tratamento de gelo-degelo, centrifugadas, dialisadas e liofilizadas, rendendo frações precipitadas em gelodegelo (AQ-P e AL-P) e solúveis em gelo-degelo (AQ-S e AL-S), assim como frações correspondentes ao sobrenadante etanólico (AQ-SE e AL-SE). Análises químicas e espectroscópicas mostraram que as frações AQ-P de ambas as microalgas são compostas por glucanas lineares ?-(1?3)-ligadas, enquanto as frações AQ-S e AQSE por glucanas ramificadas ?-(1?3,6)-ligadas. As frações alcalinas AL-P, AL-S e AL-SE, são majoritariamente compostas por proteínas e apresentam composição monossacarídica heterogênea. Essas frações foram submetidas ao teste de ligação a S. typhimurium in vitro que indicou que a maior parte das frações testadas apresenta capacidade de ligação estatisticamente igual ao controle positivo BioMos® (Alltech), principalmente as alcalinas e as ?-glucanas lineares. Também foi desenvolvido e aplicado teste para verificação do potencial prebiótico dessas frações, na avaliação do crescimento de L. acidophilus, o qual mostrou que a maior parte das frações foi estatisticamente igual ao controle positivo inulina, sendo que as frações compostas por ?-glucanas ramificadas promoveram maior variação no crescimento das culturas. Conclui-se que as microalgas utilizadas neste trabalho são boas fontes de moléculas que se mostraram ativas na modulação de bactérias que colonizam o TGI, apresentando potencial para estudos in vivo e formulação de produtos de interesse, a principio, para consumo animal. Palavras-chave: Microalgas. ?-glucanas. Prebióticos. Capacidade de ligação. Enteropatógenos.

Abstract: Microalgae are unicellular and widely distributed in nature. These organisms are considered good sources of bioactive compounds due to their diverse chemical composition and they are suitable to be cultivated on a large scale. The species used in this study were the marine microalgae Pavlova gyrans (PG) and Pavlova lutheri (PL), belonging to Haptophyta division. Different carbohydrate structures have been able to bind to enteropathogenic bacteria preventing the adhesion of pathogens to the epithelial host (fundamental stage in the onset of infection in animals and humans), and selectively increase the concentration of beneficial bacteria in the host gut, referred to as prebiotic activity. This study aimed to cultivate microalgae to obtain biomass, extract and characterize the polysaccharides in order to test it regarding their binding capacity to bacteria Salmonella enterica sv. Typhimurium ATCC 14028 and their prebiotic activity with Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. For this, the microalgae were grown in Guillard f/2 for 14 days, centrifuged and subjected to freeze-drying to obtain dry biomass. The dried biomass PG and PL was then subjected to sequential extraction (20 g/L) in water at 80 °C for 2 h under magnetic stirring, the residue was subjected to alkaline extraction (20g/L) NaOH 0,5 M at 80 °C for 2 h under magnetic stirring and centrifuged, the supernatant was neutralized with 0,1 M HCl and dialyzed. Both aqueous (AQ) and alkali (AL) supernatants were precipitated with EtOH 3 V, centrifuged and the pellet resuspended in water and subjected to freeze-thawing treatment, centrifuged, dialyzed and lyophilized, yielding precipitated fractions from freeze-thawing (AQ P and AL-P), soluble fractions (AQ-S and AL-S) and fractions corresponding to the ethanolic supernatant (AQ-SE and ALSE). Chemical and spectroscopic analysis showed that both microalgae fractions AQP are composed of linear glucans ?- (1 ? 3) -linked while AQ- S and AQ-SE fractions of branched glucan ?- (1 ? 3,6) -linked. Alkaline fractions AL-P, AL-S and AL-SE, are mainly composed of proteins and present heterogeneous monosaccharide composition. These fractions were subjected to the test of binding capacity to S. typhimurium which indicated that most of the fractions tested shows binding capacity statistically equal to BioMos® positive control (Alltech), especially the alkaline and linear ?-glucans. It has also been developed and implemented test to determine the prebiotic potential of these fractions, to evaluate the growth of L. acidophilus, which showed that most of the fractions was statistically similar to the positive control inulin, and the fractions consisting of branched ?-glucans promoted higher variation in growth. It was concluded that the microalgae used in this work are good sources of molecules that were active in the modulation of bacteria colonizing the gut, with potential for in vivo studies and formulation of products of interest, at first, in animal industry. Keywords: Microalgae. ?-glucans. Prebiotics. Binding capacity. Enteropathogens.