Análise proteômica e metabolômica de Azospirillum brasilense FP2 e seu mutante ntrC em condinções de alto e baixo amônio

Abstract

Resumo: O gênero Azospirillum inclui microrganismos de vida livre capazes de colonizar e promover o crescimento de gramíneas e cereais, como milho, sorgo, trigo, arroz e aveia. O Azospirillum é capaz de fixar nitrogênio e se associar às raízes dessas plantas, podendo transferir parte do nitrogênio fixado ao vegetal (aproximadamente 10% das necessidades da planta). Dentre as 16 espécies descritas para o gênero, Azospirillum brasilense é a mais estudada. O sistema ntr regula o metabolismo de nitrogênio em A. brasilense, incluindo os genes responsáveis pela fixação. Esse sistema é composto pelas proteínas codificadas pelos genes glnD, glnB, glnZ, ntrB e ntrC. A proteína GlnD é capaz de sensoriar a glutamina intracelular e agir como uridililtransferase (Utase/UR) em resposta aos níveis de nitrogênio. Em condições de limitação de nitrogênio, GlnD adiciona grupos uridilil (UMP) às proteínas PII, GlnB e GlnZ, na preseça de ATP e 2-oxoglutarato. GlnB uridililada não interage com a histidina kinase NtrB, que, na sua forma livre, fosforila NtrC. NtrC ativa a transcrição de genes em resposta aos níveis de nitrogênio de maneira dependente de sigma 54 (RpoN). NtrB e NtrC compõem um sistema de dois componentes, no qual NtrB é capaz de fosforilar NtrC quando o nitrogênio intracelular é baixo. Por outro lado, a presença de nitrogênio resulta na defosforilação e consequente inativação de NtrC. O regulon NtrC já foi estabelecido em estudos anteriores para diversos organismos, incluindo Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti e Pseudomonas putida. Esses estudos mostraram a função global regulatória de NtrC nesses organismos e sugerem que esse ativador está envolvido na expressão de genes relacionados a transporte e catabolismo de compostos nitrogenados, assim como na regulação central de redes metabólicas. Em A. brasilense, NtrC atua como ativador transcricional de glnBglnA, glnZ e outros operons envolvidos em assimilação de nitrogênio. Em baixo nitrogênio, a transcrição de glnB aumenta em cinco vezes através da ação de NtrC e de maneira dependente do promotor sigma 54 de glnB. Além disso, GlnB é capaz de modular sua própria expressão, uma vez que controla a atividade de NtrB e, consequentemente, NtrC. GlnB uridililada é essencial para a atividade de NifA, ativador trancricional dos genes nif. Essa regulação é independente de NtrC, pois mutantes ntrC são capazes de fixar nitrogênio. NtrC também regula glnZ, que tem sua expressão aumentada sob limitação de nitrogênio. Em A. brasilense, GlnZ não está envolvido na atividade de NtrB-NtrC, contrário ao que ocorre em E. coli. O metabolismo geral do nitrogênio em A. brasilense compreende uma cascata complexa e não totalmente elucidada. O objetivo deste trabalho é utilizar uma abordagem proteômica e metabolômica para avaliar a resposta de A. brasilense FP2 e seu mutante ntrC cultivados em baixo e alto amônio, a fim de elucidar possíveis novos alvos de NtrC. Foi possível obter uma lista de proteínas que respondem ao baixo amônio na estirpe selvagem e mutante, possibilitando uma melhor compreensão da regulação do metabolismo de nitrogênio nesse organismo e também definir novos alvos de NtrC. Foi sugerida a participação de NtrC na resposta a estresse oxidativo e na capacidade de promoção de crescimento em plantas, especialmente para os parâmetros relacionados à raíz. Palavras-chave: Azospirillum brasilense. PII. Sistema ntr. Nitrogênio. NtrC. FP2.

Abstract: The Azospirillum genus includes free-living microrganisms able to colonize and promote the growth of important cereals and grasses, such as maize, sorghum, wheat, rice and oat. Azospirillum is able to fix nitrogen in association with plant roots and transfer to plant part of the N fixed (about 10% of the plant needs). Among 16 Azospirillum species described, Azospirillum brasilense is the most studied. The ntr system regulates nitrogen metabolism in A. brasilense, including nitrogen fixation. This system is composed of the proteins encoded by the genes glnD, glnB, glnZ, ntrB and ntrC. The GlnD protein is able to sense intracellular glutamine and acts as an uridylyltransferase/uridylyl-removing enzyme (UTase/UR) in response to nitrogen levels. Under limiting nitrogen conditions, GlnD adds uridylyl groups (UMP) to the PII proteins, GlnB and GlnZ, in the presence of ATP and 2-oxoglutarate. Uridylylated GlnB cannot interact with the histidine kinase NtrB, which, in its free form, is able to phosphorylate NtrC. NtrC is an enhancer binding protein that controls the transcription of nitrogen regulated promoters, in a sigma 54 (RpoN) factor dependent manner. NtrB and NtrC compose a two-component system in which NtrB is capable of phosphorylating NtrC when nitrogen levels are low. On the other hand, the presence of nitrogen results in dephosphorylation and subsequent inactivation of NtrC. Previous studies defined the NtrC regulon for a number of organisms, including Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti and Pseudomonas putida. These studies showed the global regulatory function of NtrC in these organisms and suggested that NtrC is involved in the expression of genes related to transport and catabolism of nitrogen compounds, as well as regulation of central metabolic networks. In Azospirillum brasilense, NtrC acts as a transcriptional activator of glnBglnA, glnZ and other operons involved in nitrogen assimilation. In a nitrogen limiting condition, transcription of glnB increased five-fold mediated by the action of phosphorylated NtrC acting at the glnB sigma 54 factor dependent promoter, thus GlnB is able to regulate its own expression, since it controls the activity of NtrB and, consequently, NtrC. Uridylylated GlnB is essential for the activity of NifA, the transcriptional activator of nif genes. This regulation is independent of NtrC, as evidenced by the fact that ntrC mutants are able to fix nitrogen. NtrC also regulates glnZ and its expression is increased under limiting nitrogen. In A. brasilense, GlnZ was not found to be involved in the activity of NtrB-NtrC, in contrast to what occurs in E. coli. The general nitrogen metabolism in A. brasilense comprises a complex and yet not fully elucidated regulatory cascade. The aim of this work was to contrast the proteomic and metabolomic responses in A. brasilense FP2 and its ntrC mutant when grown in high and low nitrogen. The goal was to better understand the nitrogen metabolism regulation in this organism and to also find new targets for the transcriptional activator NtrC. It was determined a list of proteins that respond the low ammonium condition in the wild type and in the mutant, leading to a better understanding of the nitrogen metabolism regulation in this organism and also define new targets for NtrC. It was suggested that NtrC participates in the oxidative stress response and in the ability to promote plant growth, especially for the parameters related to the root.