Avaliação da colonização de Triticum aestivum e Setaria viridis por Azospirillum brasilense HM053, uma estirpe excretora de íons amônio

Abstract

Resumo: O nitrogênio é um elemento essencial para o crescimento das plantas. Na produção agricultura, fertilizantes nitrogenados têm sido utilizados no campo. No entanto, o seu uso excessivo pode gerar danos ambientais como contaminação dos solos, áreas costeiras e causar eutrofização dos rios. Uma alternativa viável para reduzir esses danos ambientais seria o uso de biofertilizantes. Neste trabalho foi utilizada a bactéria diazotrófica A. brasilense que possui a enzima nitrogenase capaz de converter o nitrogênio atmosférico (N2) em amônio (NH4+), forma assimilável pela planta. O primeiro objetivo desta tese foi caracterizar o processo de colonização pelo mutante espontâneo de A. brasilense (estirpe HM053) em plantas de trigo. Para isto, o gene repórter gusA fusionado ao gene nifH foi utilizado nas estirpes selvagem FP2 (denominada FP2-7) e HM053 (denominado HM053-36) que apresentaram a mesma capacidade de fixar nitrogênio in vitro e colonizar as raízes de trigo quando comparado às estirpes originais FP2 e HM053. Deste modo, foi possível observar significativa atividade da GusA localizada principalmente nos pontos de emissão das raízes laterais. Para o mutante HM053 esta atividade foi substancialmente mais forte e a expressão do gene nifH foi 278 vezes mais alta quando comparado a estirpe selvagem FP2. O segundo objetivo desta tese foi caracterizar o mutante HM053 em plantas de Setaria viridis. Com o uso de nitrogênio marcado (13NN) foi possível provar que plantas de S. viridis inoculadas com este mutante assimilaram nitrogênio até 16 vezes mais do que plantas inoculadas com a estirpe selvagem FP2. Além disso, plantas de S. viridis inoculadas com o mutante HM053 responderam melhor à inoculação quando comparado a FP2 e ao mutante FP10, que é incapaz de fixar nitrogênio. Plantas inoculadas com a estirpe FP10 apresentaram significativo ganho somente no número de raízes laterais, o que pode ser explicado pelo fato de A. brasilense produzir fitormônios como a auxina. Já plantas inoculadas com as estirpes HM053 e FP2 apresentaram significativo aumento do comprimento da raiz, número de raízes laterais e massa seca da raiz. Interessantemente, somente plantas inoculadas com a estirpe HM053 apresentaram aumento significativo na produção de grãos (aumento de 34% em relação ao controle). No momento, está em andamento a análise do transcriptoma de raízes de S. viridis inoculada com as estirpes FP2, FP10 e HM053 e em breve será possível traçar um perfil molecular entre o processo de interação S. viridis - A. brasilense, o que contribuirá de maneira geral para o melhor entendimento do processo de interação planta - bactéria. Nesta tese, os efeitos benéficos da inoculação com o mutante espontâneo HM053 de A. brasilense tornam esta estirpe um biofertilizante promissor para ser utilizado no campo de acordo com as normas do Ministério da Agricultura. Palavras-chave: Trigo, Setaria viridis, Azospirillum brasilense, nifH e transcriptoma.

Abstract:Nitrogen is an essential nutrient used by plants for growth. In crop production, nitrogen fertilizers have been used in the field. However, excess nitrogen can create environmental problem in soil fields, coastal areas and river eutrophication. A viable alternative way to reduce these environmental problems is with the use of biofertilizers. Here in, it was used the diazotrophic bacterium A. brasilense that contain the enzyme nitrogenase, which is capable of converting atmospheric nitrogen (N2) into ammonia (NH4+) as a nitrogen source that can be utilized by plants. The first goal for this thesis was to characterize the colonization process of a spontaneous mutant of A. brasilense (strain HM053) in wheat plants. To analyze wheat - A. brasilense interaction nifH::gusA fusions in the wild type FP2 (denominated FP2-7) and HM053 (denominated HM053-36) were used and showed similar levels of colonization and nitrogen fixation as original strains FP2 and HM053. Although HM053-36 and FP2-7 showed significant GusA activity located mainly at lateral root emergence points, HM053 consistently showed stronger signals and expressed the nifH gene 278-fold higher than FP2 in planta. The second goal for this thesis was to characterize HM053 in Setaria viridis plants. To test this, it was measured the ability of S. viridis plants inoculated with HM053 to fix13NN. Plants inoculated with HM053 fixed nitrogen 16-fold higher than plants inoculated with FP2. Furthermore, S. viridis plants inoculated with HM053 responded better than plants inoculated with FP2 or an FP10 strain, which is unable to fix nitrogen. Plants inoculated with FP10 only showed a significant increase the number of lateral roots since A. brasilense has the ability to produce phytohormones, such as auxin. Inoculation of plants with HM053 and FP2 strains showed an increase of root length, lateral root number and root dry weight. Interestingly, plants inoculated with HM053 showed a 34% increase in the number of plant seeds compared to control plants. At present, transcriptome analysis of S. viridis inoculated with FP2, FP10, or HM053 is being processed to help better understand the crosstalk between plants and bacteria at the molecular level. In this thesis, the A. brasilense spontaneous mutant HM053 showed a beneficial symbiotic effect, which could be used in the field if it complied with the Brazilian Ministry of Agriculture. Keywords: Wheat, Setaria viridis, Azospirillum brasilense, nifH and transcriptome.