A molecular and epidemiological study of Fasciola hepatica in Brazil

Abstract

Resumo: A fasciolose, causada principalmente pela espécie Fasciola hepatica, é uma doença comum na pecuária (bovinos, ovinos, bubalinos e caprinos) responsável por perdas econômicas significativas. A doença também tem destaque como uma importante zoonose humana, onde até 17 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo. O objetivo deste trabalho foi estudar a prevalência da doença em humanos, bovinos e búfalos aquáticos sob diferentes aspectos no Brasil e investigar novas alternativas de tratamento. A presente tese está dividida em introdução, revisão de literatura, objetivos, cinco capítulos e considerações finais. O primeiro capítulo mostra uma recontagem de casos de fasciolose humana (FH) no Brasil nos últimos 60 anos, onde foram encontrados 48 casos na literatura fornecendo um cenário atualizado da doença no país. No segundo capítulo é referente a investigação de FH em Piraquara, Paraná (PR) e Balneário Piçarras, Santa Catarina (SC). Neste capítulo, reportamos o primeiro caso positivo de FH em SC. A partir do nosso relatório, as autoridades locais foram notificadas para investigar outros possíveis casos, áreas de risco e fontes de contaminação. O terceiro capítulo é um estudo sobre a determinação da prevalência de anticorpos anti-F. hepatica em vacas leiteiras para avaliar a relação entre os níveis de anticorpos Fasciola-específico (F. hepatica catepsina L1 recombinante - FhCL1r) em tanques de leite e parâmetros de qualidade do leite em 1492 amostras do PR. A prevalência média no estado foi de 9,72%, enquanto a maior prevalência foi encontrada na região metropolitana de Curitiba (42,86%); Centro Oriental (13,01%); Noroeste (11,76%) e Centro Sul (8,82%). A análise de redundância, usando um modelo de regressão linear multivariado, mostrou que os teores de proteína do leite, lactose e extrato seco desengordurado foram menores nas amostras positivas em comparação com as negativas. O quarto capítulo mostra a prevalência de F. hepatica em bubalinos abatidos de 2003 a 2017 no Brasil. A análise dos dados mostrou uma prevalência total de 7187 casos (3%) de 226.561 indivíduos. A doença foi mais prevalente no PR, Rio Grande do Sul e SC (11,9; 7,7 e 3,2% para fígados condenados, respectivamente). Modelos preditivos indicaram uma tendência constante da doença, destacando a necessidade de acompanhamento regular. Finalmente, no quinto capítulo investigamos o mecanismo envolvido na inibição da catepsina L3 de F. hepatica (FhCL3) por seu propeptídeo (pp). ppFhCL3 é um inibidor altamente potente de duas catepsinas colagenolíticas de F. hepatica, FhCL3 e FhCL2 envolvidas no estabelecimento da infecção por F. hepatica. Além disso, propomos o mecanismo "clamp" envolvendo resíduos do pp que interagem com a alça de ligação (Tyr46p, Lys47p) e o sítio ativo com o substrato (Leu66p) para a correta ligação e inibição das catepsinas colagenolíticas de F. hepatica. Juntos, esses resultados mostraram uma atualização epidemiológica da doença, aproximando-se da prevalência humana e animal. Além disso, novas possibilidades de projetar inibidores seletivos para as catepsinas de Fasciola foram explorados. Palavras-chave: Trematodas. Doenças de origem alimentar. Fasciolose. Imunodiagnóstico no leite. Catepsina.

Abstract: Fascioliasis, caused mainly by Fasciola hepatica, is a common disease of livestock (cattle, sheep, water buffalo and goats) responsible for significant economic losses. The disease also stands out as an important human zoonosis, where up to 17 million people are infected worldwide. The aim of this work was to study the prevalence of the disease in humans, cattle and water buffalos under different aspects in Brazil and to investigate new treatment alternatives. The present thesis is divided in Introduction, Literature Review, objectives, five chapters and Final Considerations. The first chapter shows a recount of human fascioliasis (HF) cases in Brazil over the last 60 years, where, 48 cases were found in the literature providing an updated scenario of the disease in the country. The second chapter shows an investigation of HF in Piraquara, Paraná (PR) and Balneário Piçarras, Santa Catarina (SC). In this chapter, we reported the first HF positive case in SC. From our report, local authorities were notified in order to investigate other possible cases, risk areas and the source of contamination. The third chapter is a study about the determination of the prevalence of anti-F. hepatica antibodies in dairy cattle to assess the relationship between Fasciola-specific cathepsin L1 (FhCL1r) antibody levels in bulk tank milk and milk quality parameters in 1,492 samples from PR. The average prevalence in the state was 9.72%, while the highest prevalence was found in the Metropolitan area of Curitiba (42.86%); Eastern Center (13.01%); Northwest (11.76%) and South Center (8.82%). Redundancy analysis, using a multiple multivariate linear regression model, showed that milk protein, lactose and defatted dry extract contents were lower in the positive samples compared to the negative ones. The fourth chapter shows the prevalence of F. hepatica in buffaloes slaughtered from 2003 to 2017 in Brazil. Data analysis revealed a total prevalence of 7,187 cases (3%) out of 226,561 individuals. The disease was more prevalent in PR, Rio Grande do Sul, and SC (11.9; 7.7; and 3.2% for condemned livers, respectively). Predictive models indicated a constant trend of the disease, highlighting the need for regular monitoring. Finally, in the fifth chapter we investigated the mechanism involved in inhibition of the F. hepatica cathepsin L3 (FhCL3) by its propeptide (pp). ppFhCL3 is a highly potent inhibitor of two F. hepatica collagenolytic cathepsins, FhCL3 and FhCL2 involved in the establishment of F. hepatica infection. Also, we propose that "clamp" mechanism involving residues of the pp that interacting with the propeptide binding loop (Tyr46p, Lys47p) and substrate bind cleft (Leu66p) is necessary for the correct bind and inhibition of F. hepatica collagenolytic cathepsin. Together, these results have shown an epidemiological update of the disease, approaching human and animal prevalence. Besides that, new possibility of designing selective inhibitors for Fasciola cathepsins were explored. Keywords: Trematodes. Food-borne Disease. Fascioliasis. Milk immune-diagnosis. Cathepsin.