Otimização da produção de enzimas amilolíticas por macromicetos para aplicação na indústria de alimentos

Abstract

Resumo: As amilases são enzimas com amplas aplicações industriais, as quais podem ser produzidas por basidiomicetos saprófitos, não patogênicos, atraindo grande interesse comercial, devido à facilidade de cultivo e produção enzimática extracelular. A seleção de cepas de basidiomicetos com maior potencial na produção de enzimas amilolíticas (?-amilase e glucoamilase) por cultivo submerso foi realizada utilizando 12 cepas. A cepa que apresentou maior potencial de produção de amilases foi Coprinus comatus (2,31 U·mL-1 em 48 horas de cultivo). Esta pesquisa é uma das poucas que avalia o potencial de basidiomicetos para a produção de amilases em cultivo submerso e a primeira reportada na literatura que avalia quantitativamente C. comatus. Em seguida, realizou-se um delineamento do tipo Plackett-Burman 11/12 para a seleção de variáveis significativas. Três fatores apresentaram efeito significativo (p<0,05) para ?-amilase e glucoamilase: amido, ureia e Fe2(SO4)3. O incremento da produção utilizando o Delineamento Composto Central Rotacional foi de 180% para ?-amilase e 1184% para glucoamilase, ao qual resultou na obtenção de dois modelos representados pelas superfícies de resposta para ambas enzimas. Na cinética final foi obtida atividade máxima em 48 horas para ?-amilase (5,84 U·mL-1; 213 U·mg-1) e em 44 horas para glucoamilase (8,87 U·mL-1; 147,93 U·mg-1). C. comatus apresentou produtividade para ?-amilase de 0,12 U·mL-1·h- 1, em 48 horas de cultivo com fator de conversão de substrato em biomassa (YAX/S) de 0,02 g de biomassa (gdb). g-1 de substrato (gds), de substrato em enzima (YAP/S) de 508,34 U·gds-1 e de biomassa em enzima (YAP/X) de 25532,55 U·g-1. No meio para produção de glucoamilase esta cepa apresentou YGX/S foi de 0,02 gdb·gds-1, YGP/S de 766,20 U·gds-1 e YGP/X de 37744,54 U·g-1, com produtividade de 0,20 U·mL-1.h-1 no pico de atividade. As enzimas foram caracterizadas quanto ao pH, temperatura de reação e íons metálicos. O pH e temperatura ótimos para ?-amilase foram de 6,5 e 50ºC. Para a glucoamilase foram encontrados pH e temperatura ótimos igual a 6,0 e 50ºC. A presença do íon Mg2+ aumentou significativamente a produção de ?-amilase (43,16%). Por sua vez, glucoamilase teve um aumento de 168,46% na presença de íon Mn2+ e 157% na presença de Ca2+. A otimização da atividade enzimática de C. comatus aumentou a atividade de ?-amilase em 153% em relação a atividade obtida na seleção e para glucoamilase houve um aumento de 2234%.

Abstract: Amylases are enzymes with broad industrial applications, which can be produced by non-pathogenic saprophytic basidiomycetes, attracting great commercial interest due to the ease of cultivation and extracellular enzymatic production. The selection of basidiomycete strains with greater potential for the production of amylolytic enzymes (?-amylase and glucoamylase) via submerged culture was carried out using 12 strains. The strain with the highest potential to produce amylases was Coprinus comatus (2,31 U·mL-1 in 48 hours of culture). This research is one of the few that evaluates the potential of basidiomycetes for the production of amylases in submerged culture and the first one reported in the literature that quantitatively evaluates C. comatus. Next, a Plackett-Burman Screening Design 11/12 was carried out to select the significant variables. Three factors presented significant effect (p<0,05) for ?-amylase and glucoamylase: starch, urea and Fe2(SO4)3. The increase in production using Rotational Central Composite Design, 180% for ?-amylase and 1184% for glucoamylase, resulted in two models represented by the surface of response for both enzymes. In the final kinetics, the maximum activity was obtained after 48 hours for ?-amylase (5,84 U·mL-1; 213 U·mg-1) and in 44 hours for glucoamylase (8,87 U·mL-1; 147,93 U·mg-1). The C. comatus showed a 48 hour productivity for a-amylase of 0,12 U·mL-1·h-1, with a substrate conversion factor in biomass (YAX/S) of 0,02 g of biomass (gdb).g-1 of substrate (gds), enzyme substrate (YAP/S) of 508,34 U·gds- 1 and biomass in enzyme (YAP/X) of 25532,55 U·g-1. In the medium for the production of glucoamylase is available in YGX/S was 0,02 gdb·gds-1, 766,20 U·gds-1 YGP/S and 37744,54 U·g-1 YGP/X, yielding 0,20 U·mL-1·h-1 at peak activity. The enzymes were characterized for pH, reaction temperature and metallic ions. Optimal pH and temperature for ?-amylase were 6,5 and 50ºC, while for glucoamylase they were 6,0 and 50ºC. The presence of Mg+2 ion increased significantly the ?-amylase production (43,16%). Glucoamylase, in turn, had an increase of 168,46% in the presence of Mn+2 ion and 157% in the presence of Ca+2. The optimization of the C. comatus enzymatic activity increased the ?- amylase activity in 153% in relation to the activity obtained in the selection, while the increase in glucoamylase was 2234%.