Caracterização de interações realizadas pelo domínio citoplasmático da semaforina 5B

Abstract

Resumo: A correta ligação dos axônios aos seus alvos específicos é essencial para o desenvolvimento do sistema nervoso. As semaforinas pertencem a uma grande família de proteínas secretadas ou associadas à membrana, envolvidas na navegação axonal, fasciculação, ramificação e formação de sinapses, além da participação na progressão tumoral, angiogênese e diferenciação de linfócitos B. As semaforinas de classe 5 são proteínas transmembrânicas que contém sete repetições trombospondinas. Os principais representantes desta classe são a Sema5A e a Sema5B. Não há na literatura nenhum estudo sobre a atuação destas proteínas como transdutoras de sinal. Inumeras questões sobre esta molécula permanecem em aberto, tais como sua modulação, expressão celular e via de sinalização reversa. Em trabalho anterior, foi realizada uma varredura através do sistema de duplo-híbrido em leveduras para a identificação de alguns ligantes do domínio citoplasmático da Semaforina 5B (Sema-Cito5B). No presente trabalho, um número maior de clones obtidos naquela varredura foi analisado (totalizando 410 clones). Destes, 40 clones foram passíveis de sequênciamento, resultando na identificação de um painel composto por 26 diferentes proteínas, 13 confirmadas como positivas pelo duplo-híbrido. Esse painel inédito de ligantes putativos para Sema5B poderá contribuir para a melhor compreensão dessa proteína, sobretudo com relação ao seu papel como receptora e sinalizadora. A partir de informações da literatura, 5 proteínas foram selecionas para confirmar os resultados encontrados. Alguns destes ligantes estão envolvidos no mecanismo de ubiquitinação, como Stub1 e Mib2, que são enzimas E3-ligases de ubiquitina; e Usp33, uma enzima deubiquitinante envolvida diretamente na migração de neurônios. Uba2, outro ligante escolhido participa da via de SUMOilação, como enzima ativadora E1. Cript foi escolhida por sua afinidade por proteínas do citoesqueleto e por estar relacionada à modulação de sinalização de PSD-95. Plasmídeos de expressão em células de mamíferos foram montados para expressar integralmente os ligantes selecionadas em fusão com etiqueta Myc. Para Sema5B, foram montados vetores para expressá-la integralmente com ou sem a presença de etiquetas His. Para região citoplasmática da Sema5B foram montados plasmídeos para expressa-la em fusão a uma etiqueta His e à proteína fluorescente EGFP. As expressões bem sucedidas dos ligantes Usp33, Uba2, Stub1 e Cript foram empregadas em ensaios de pull-down com Sema5B-his expressa em HEK293 ou com Sema-Cito5B-His produzida em bactérias. Em ambos os ensaios as interações de Sema5B com Usp33 e com Stub1 foram confirmadas. Os resultados sugerem que tais interações podem estar envolvidas na estabilidade/reciclagem do domínio citoplasmático da Semaforina 5B, ou ainda no crescimento axonal. Palavras-chave: Semaforina. Ubiquitinação. SUMOilação. Sistema de duplo híbrido. Sema5B. Usp33. Uba2. Stub1. Cript. Pull-down. Vetores de expressão.

Abstract: In the developing neuron system, the correct axon guidance is essential for linking the axons to their targets. The Semaphorins belongs to a large family of secreted and membrane associated proteins, which are involved on axon navigation, fasciculation and synaptic formation, besides the role on tumor progression, angiogenesis and B-lymphocyte differentiation. Class 5 Semaphorins are transmembrane proteins which contains seven repetitions of thrombospondins. Sema5A and Sema5B are the most prominent members of this class. Few studies regarding the role of Sema5B are available, and none about reverse signaling. Questions about modulation, cellular expression and reverse signaling are yet to be answered. On a previous work, an yeast two-hybrid screening using the cytoplasmic domain of Sema5B provided 410 clones for analysis. Fourty clones were sequenced, resulting on a panel containing 26 possible molecular partners. After further tests, nine of them were positive for interactions. This novel panel of Sema5B putative ligands contributes for a better comprehension of Sema5B role as a receptor and as a signal transducer protein. Five proteins, Usp33, Uba2, Stub1, Cript and Mib2, were chosen for further investigations. Stub1 and Mib1 are both E3 Ubiquitin ligases; Usp33 is a Deubiquitinating enzyme; Uba2 is a E1 SUMOilation activating enzyme; and Cript was chosen based on its affinity between cytoskeleton and other proteins, and its role as PSD-95 modulating and signalizing protein. Mammallian cells expressing vectors were assembled in order to express Sema5B and putative ligands in fusion with tag proteins: Sema-Cito5B expressing His tag and EGFP fusion proteins; full length Sema5B expressing His tag fusion proteins; and a Myc tag was the choice for the putative ligands tag. Usp33, Uba2, Stub1 and Cript together with Sema5B-His or with prokaryotic Sema-Cito5B-His were applied in a pull-down assays. Usp33 and Stub1 interactions were confirmed. This result suggests that these proteins might be involved on stability and recycling of the cytoplasmic domain of Sema5B and axonal growth modulation. Key words: Semaphorin. Ubiquitination. SUMOilation. y2h. yeast 2 hybrid. Sema5B. Usp33. Uba2. Stub1. Cript. Pull down. Expressing vectors. Plasmids