Investigação da existência de ritmicidade circadiana de enzimas antioxidantes em Zebrafish (Danio rerio) e sua desregulação à exposição ao cobre

Abstract

Resumo: Todos os seres vivos possuem um sistema marcador de tempo que é sincronizável com o ambiente onde vivem. À vista disso, uma estreita ligação entre o ritmo circadiano e processos fisiológicos relacionados à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de enzimas antioxidantes é relatada em diversos organismos. Por sua vez, o sulfato de cobre (CuSO4) é um composto conhecidamente pró-oxidante e amplamente utilizado em aquicultura como agente terapêutico em peixes. Ele é frequentemente utilizado em concentrações que chegam a ser de sete até cem vezes maiores do que as encontradas em ambientes com influência de atividades antrópicas. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico do sulfato de cobre em diversos organismos aquáticos, a investigação das consequências da exposição a esse metal, e consequente promoção de estresse oxidativo, no ritmo circadiano ainda não foi examinada. Nesta tese, foi avaliado o efeito e possíveis mecanismos moleculares envolvidos na resposta celular das defesas antioxidantes e de proteínas chaves envolvidas na marcação da ritmicidade circadiana em peixes Danio rerio e na linhagem celular derivada de embriões da mesma espécie (PAC-2) expostos ao CuSO4. No primeiro capítulo, estudos bioquímicos e de expressão gênica, juntamente com análises químicas indicaram que a exposição hídrica ao CuSO4 interferiu com a coordenação entre as enzimas SOD e CAT e perturbou a oscilação diária de proteínas de controle do relógio. Ainda, evidências concretas sobre a existência de ritmicidade na expressão e atividade de SOD e CAT foram encontradas. Estes resultados indicaram que a sincronização do organismo com o ambiente pode ser prejudicada devido à exposição aguda ao sulfato de cobre. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar de maneira mais aprofundada as bases moleculares do cross-talk entre o cobre, as enzimas antioxidantes SOD e CAT e o relógio circadiano. Com a utilização de técnicas de clonagem molecular, transfecções e quantificação de expressão gênica, os resultados obtidos apoiam fortemente uma relação entre exposição aguda ao Cu, ativação da defesa antioxidante e distúrbios na expressão de genes envolvidos no controle do relógio circadiano através da ativação da via de sinalização da MAPK em células PAC-2. Além disso, também foi demonstrado que a transcrição da SOD pode ser regulada tanto em resposta ao estresse oxidativo como também associada ao relógio circadiano. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre exposição ao Cu e desregulação do mecanismo de controle do relógio circadiano em organismos aquáticos. Palavras chave: zebrafish, sulfato de cobre, defesa antioxidante, ritmicidade circadiano

Abstract: All living beings present a time-marking system that can synchronize with the environment where they live. A close link between the circadian rhythm and physiological processes related to the production of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes is reported in several organisms. Copper sulfate (CuSO4), in turn, is a compound known as pro-oxidant and widely used in aquaculture as a therapeutic agent in fish. It is frequently applied in concentrations between seven to one hundred times greater than as found in environments with influence of anthropic activities. Although many studies have demonstrated the toxic potential of copper ions in various aquatic organisms, an investigation of the consequences of CuSO4 exposure, consequent promotion of oxidative stress, and the circadian rhythm has not yet been examined. In this thesis, we evaluated the effect and possible molecular mechanisms involved in the cellular response of antioxidant defenses and key proteins involved in circadian rhythm in Danio rerio and in the cell line, PAC-2, derived from embryos of the same species, exposed to CuSO4. In the first chapter, biochemical and gene expression studies along with chemical analyzes indicated that exposure to CuSO4 interfered with the coordination between SOD and CAT enzymes and disrupted the daily oscillation of circadian rhythm control proteins. Moreover, concrete evidence on the existence of rhythmicity in the expression and activity of SOD and CAT were found. These results indicated that a synchronization of the organism with the environment may be impaired due to acute exposure to Cu. In this way, the second chapter was conducted in order to explore the molecular bases of the cross-talk between copper, SOD and CAT antioxidant enzymes and the circadian clock. With the use of molecular cloning techniques, transfections and gene expression, the results obtained support a relationship between Cu exposure, activation of the antioxidant defense and disorders in the expression of circadian clock control genes through the activation of the MAPK pathway in PAC-2. It has also been shown that the transcription of SOD can be regulated both as a response to oxidative stress and also associated with the circadian clock. In general, this study provides the first information about the toxicological interaction between Cu exposure and deregulation of the circadian clock control mechanism in aquatic organisms. Key words: zebrafish, copper sulfate, antioxidant defense, circadian rhythm