Nanocristais de celulose bacteriana carboxilados para imobilização de anticorpos e desenvolvimento de biossensores piezoelétricos

Abstract

Resumo: Novos materiais desenvolvidos a partir de fontes naturais de origem renovável, biocompatíveis e de baixo custo vêm recebendo atenção da academia e da indústria, e duas fontes promissoras são os cristais de celulose (NC) e as xiloglucanas (XG) de sementes de Tamarindus indica. O objetivo desta tese se baseou no desenvolvimento de materiais suportes a base desses polissacarídeos e, de acordo com as publicações geradas, a tese foi dividida em três partes. Na primeira (1), foi realizada a adsorção de XG em camadas de NC com quatro diferentes graus de sulfatação e de potencial zeta [0% SO3 -, isolado com HCl (? -4,8 mV); 0.42% SO3 -, usando uma mistura de HCl e H2SO4 (? -39,6 mV); e 0,65% SO3 -, usando somente H2SO4 (? -45,6 mV)]. A interação foi investigada através de várias técnicas [isotermas de Langmuir, microscopia de força atômica (AFM), ângulo de contato, espalhamento de luz dinâmico, elipsometria e medidas por microbalança de cristal de quartzo (QCM)]. Os experimentos de adsorção em água e por layer by layer (LbL) sugerem que o maior grau de esterificação na superfície de NC (0,65% SO3 -) prejudica a capacidade máxima de adsorção da XG e cria camadas adsorvidas instáveis. Entretanto, para o grupo 0,42% SO3 - não foi verificada alterações significativas na adsorção da XG além de ter uma maior estabilidade coloidal do que o grupo 0% SO3 - e de formar filmes mais estáveis, com menor rugosidade e espessura. Mas, testes iniciais de formação de filmes de XG com NC submetidos a oxidação com o reagente TEMPO apresentaram delaminação e foram descartados para a etapa de produção de biossensores bidimensionais. Na segunda parte (2), sensores piezoelétricos foram revestidos com filmes de NC e em seguida foi imobilizado anticorpos monoclonais IgG específicos para o antígeno NS1 do vírus da dengue. O revestimento do sensor foi acompanhado por AFM, QCM e QCM-D. O sensor desenvolvido foi capaz de detectar o antígeno NS1 em amostras de soros sanguíneos simulados no intervalo de concentração de 0,01 à 10 ?g.mL-1. O revestimento ainda proporcionou a capacidade de reconhecimento de NS1 através de ambos os equipamentos, QCM-D e QCM, com limites de detecção de 0,1 ?g.mL-1 e 0,32 ?g.mL-1, respectivamente. Na terceira parte (3), na tentativa de baratear o sensor desenvolvido na metodologia do artigo anterior, foi proposta a otimização do procedimento de obtenção de NC. Para isso, foi verificada a influência de prétratamentos mecânicos antes do procedimento de hidrólise da celulose. As amostras foram segregadas em relação ao grau de intensidade do tratamento mecânico, sendo: (a) agitação mecânica, (b) trituração, (c) cisalhamento por 20 passagens por moinho e (d) cisalhamento por 40 passagens por moinho. E foram caracterizadas por reologia, AFM, difração de raios-x e rendimento de NC isolados. De acordo com os resultados obtidos, não foi verificada diferença significativa do pré-tratamento para produção de NC. Assim, sugere-se que não é necessário um pré-tratamento mecânico e, com isso, o custo final da obtenção de NC pode ser diminuído. Palavras-chave: Xiloglucana. Nanocristais de celulose. Biossensores. Dengue. Filmes finos. Proteína NS1

Abstract: Novel materials developed from renewable and natural sources with biocompatibility and low cost have receiving great attention from academia and industry. Two promises sources are cellulose nanocrystals (NC) and xyloglucan (XG) from Tamarindus indica. seeds. At present thesis, the main goal was the development of support materials based on these two polysaccharides. In according to published papers, this thesis was organised in three sections. The first (1), the adsorption behavior of XG on layers of bacterial cellulose nanocrystals (BCN) with four different sulfate content and zeta potential (?) values [0% SO3 -, using only HCl (? -4.8 mV); 0.42% SO3 -, using a mix of HCl and H2SO4 (? -39.6 mV); and 0.65% SO3 -, using only H2SO4 (? -45.6 mV)] was investigated. The adsorption was evaluated by several techniques (Langmuir isotherms, atomic force microscopy, contact angle, dynamic light scattering, ellipsometry and quartz crystal microbalance measurements). The experiments in water suspension and layer by layer (LbL) suggest that high sulfate substitution on BCN surface (0.65% SO3 -) impairs the original interaction with XG, resulting in lower maximum adsorbed amount (Qmax) of XG on BCN and unstable deposited layers with desorption. Therefore, 0.42% SO3 - did not significantly impair XG adsorption, and the greater colloidal stability than 0% SO3 - resulted in higher XG mass adsorption in water suspension and thin films with lower roughness, thickness and without desorption. However, initial test of XG films with NC subjected to oxidation with the TEMPO reagent presented delamination and were discarded for the production stage of twodimensional biosensors. In the second section (2), piezoelectric sensors were previously coated with thin films of bacterial cellulose nanocrystals (CN) to provide a more sensitive and adapted interface for the attachment of monoclonal immunoglobulin G (IgGNS1) and to favor specific detection of non-structural protein 1 (NS1) of dengue fever. The assembly of the immunochip surface was analyzed by atomic force microscopy (AFM) and the NS1 detection was followed by quartz crystal microbalance with (QCM-D) and without energy dissipation monitoring (QCM). The CN surface was able to immobilize IgGNS1, as confirmed by AFM topography and phase images along with QCM-D. The system was able to detect the NS1 protein in serum simulated in the range of 0.01- 10 ?g.mL-1, by both QCM and QCM-D. The limits of detection of the two devices were 0.1 ?g.mL-1 for QCM-D and 0.32 ?g.mL-1 for QCM. At last (3), in order to optimize and reduce the cost of piezoeletric immunochip, was proposed a study to optimize the hydrolysis procedure. For this, the influence of mechanical pretreatment before the hydrolysis procedure was verified on the pristine cellulose submitted to four different mechanical process: (1) magnetic stirring, (2) blender, and milled by (3) 20 and (4) 40 passages in supermasscolloider mill. All the samples were evaluated according to yield, morphology and size (atomic force microscopy), crystallinity (x-ray diffraction). Not all CNC differed in evaluated characteristics suggesting that, intense mechanical pretreatment are not exclusively required, prior to hydrolysis. Key-words: Xyloglucan. Celulose nanocrystals. Biossensors. Dengue. Thin films. NS1 protein.