Biocatálise em ambientes aquo-restritos : comparação de diferentes sistemas reacionais

Abstract

Resumo: As lipases fazem parte da classe de hidrolases, cuja classificação internacional é "glicerol éster hidrolases E.C. 3.1.1.3 ". De origem bacteriana, fúngica ou de mamíferos e propriedades diversas, estas enzimas podem catalisar a hidrólise e a síntese de um grande número de compostos em diferentes meios e condições reacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar a biocatálise em sistemas bifásicos micro-heterogêneos e macro-heterogêneos, utilizando o extrato lipolítico de Penicillium corylophilum (IOC 4211). Para tanto, foram estudadas a reação de hidrólise de ésteres em meio aquoso e em micelas reversas AOT/n-heptano, bem como, a síntese do oleato de n-butila no sistema micro-heterogêneos (micelas reversas) e em sistemas macro-heterogêneos (bifásicos). Foi estudada a eficiência de várias preparações enzimáticas nos sistemas, usando n-heptano como meio reacional, a saber: 1) adição direta da enzima liofilizada; 2) adição direta da enzima co-liofilizada com (3-ciclodextrina e 3) adição da enzima imobilizada em gel hidrofóbico. Inicialmente, investigou-se a produção da enzima e as propriedades do extrato lipolítico, como o efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática, e a estabilidade da enzima à temperatura e em presença de solventes orgânicos. Verificou-se que a produção máxima da enzima foi de 6,8 U.mL"1, após 144 h, a 29°C e agitação orbital de 120 rpm, em um meio composto por sais minerais, glucose e 2 % (v/v) de óleo de oliva. O extrato lipolítico apresentou maior atividade na faixa de pH entre 6,0 e 8,0, e na faixa de temperatura entre 45 e 60 °C. As lipases contidas no extrato bruto não são termoestáveis, mas apresentam estabilidade quando incubadas em presença de solventes orgânicos apoiares, de fato, quando o extrato lipolítico foi incubado em n-heptano, a enzima mostrou ativação de 14 e 30 % com atividade de água (aw) inicial no sistema de 0,53 e 0,95, respectivamente. As maiores atividades enzimáticas do extrato bruto de P. corylophilum foram encontradas para o pNPP em meio aquoso e para a trioleína em meio micelar. No meio aquoso foi observada ainda uma ativação da enzima de aproximadamente 7 vezes após a coliofilização com (3-ciclodextrina, e 2 vezes após a imobilização no gel hidrofóbico. Nas reações de esterificação, a reação modelo utilizada foi a síntese do oleato de n-butila. A síntese foi acompanhada por CCD e por CLAE, e os rendimentos foram determinados pelo método de Lowry-Tinsley. O melhor sistema para a síntese do oleato de n-butila foi de micelas reversas com Wo (teor de água) de 10 e 100 % de rendimento (12 h), seguido do sistema onde se adicionou a enzima liofilizada, com 100 % de rendimento (48 h) obtido com a"- inicial no meio reacional de 0,11. Para o sistema onde a enzima foi co-liofilizada com (3-ciclodextrina, o rendimento foi de 63 % (48 h), em aw inicial de 0,11. O sistema menos eficiente foi o que utilizou a enzima imobilizada em gel hidrofóbico, com 14 % (48 h) e aw inicial de 0,11. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que o extrato lipolítico de P. corylophilum, um fiingo isolado localmente, pode ser utilizado em reações de síntese em meios aquo-restritos, e sugerem a importância da continuidade dos estudos no sentido de purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas por P. corylophilum, e uma investigação em profundidade do potencial de uso das enzimas purificadas para a produção de compostos de química fina.

Abstract: Lipases belong to the class of hydrolases, and are classified as "glycerol ester hydrolases E C 3.1.1.3". This group includes bacterial, fungal and mammalian enzymes with diverse characteristics, united by their ability to catalyze the hydrolysis and the synthesis of a large number of compounds in different reaction media and under different conditions. The objective of this work was to study biocatalysis in macroheterogeneous and micro-heterogeneous biphasic systems, utilizing the lipolytic extract from Penicillium curylophilum (IOC 4211). The following aspects were studied: the hydrolysis of esters in aqueous solution and in AOT/n-heptano reversed micelles, and the synthesis of butyl oleate ester in a micro-heterogeneous system (reversed micelles), and in macro-heterogeneous systems (biphasic) systems. The performance of various enzyme preparations in these systems, using n-heptane as the reaction media, was studied: 1) direct addition of the lyophilized enzyme; 2) direct addition of the enzyme co-lyophilized with P-cyclodextrin and 3) addition of the enzyme immobilized on a hydrophobic support. The initial studies were undertaken to characterize the production of the enzyme and the properties of the lipolytic extract, such as the effect of pH and temperature on enzyme activity and the stability of the enzyme at elevated temperatures and in the presence of organic solvents. The maximum enzyme concentration obtained in the production studies was 6.80 U.mL"1, after 144 h of incubation on a rotary shaker at 29 °C and 120 rpm, in a medium containing mineral salts, glucose e 2 % (v/v) olive oil. The lipolytic extract showed greatest activity in the pH range 6.0-8.0 and in the temperature range 45 - 60 °C. The lipases within the crude extract are not thermostable, but do show stability when incubated in the presence of organic apolar solvents: in fact, when the extract was incubated in n-heptane, the enzyme was activated by 14 to 30 % for an initial water activity of the system (aw) of 0,53 and 0,95, respectively. The highest activities measured for the crude lipolytic extract were for the hydrolysis of pNPP in aqueous solution and for the hydrolysis of triolein in the reversed micelle system. In aqueous solution the enzyme was activated approximately seven-fold after colyophilization with p-cyclodextrin, and approximately 2-fold after immobilization in hydrophobic gel. In the esterification reactions the model reaction used was the synthesis of butyl oleate ester, with the reaction being followed by TLC and HPLC, and the yields being determined by the Lowry-Tinsley method. The best system for the synthesis of butyl oleate ester was the reversed micellar system with a Wo (water content) of 10, which gave a yield of 100 % (12 h), followed by the system in which the enzyme lyophilized was added to the medium, with a yield of 100 % (48 h), obtained at an initial aw of 0.11 in the reaction medium. For the system in which the enzyme was co-lyophilized with P-cyclodextrin, the yield was 63 % (48 h), also obtained at an initial a", of 0.11. The least efficient system was the enzyme immobilized on hydrophobic gel, with a 14 % (48 h) yield, obtained at the same initial aw of 0.11. The results obtained in this study show that the lipolytic extract of P. corylophihim, a locally-isolated fungus, can be used in synthesis reactions in low-water systems, and suggest that the studies should now proceed to the purification of lipases from the crude extract, the biochemical characterization of these lipases and an in-depth investigation of the potential for the use of purified enzymes in biocatalysis, for the production of fine chemicals.