Análise metagenômica do microbioma de mangue do Litoral do Paraná

Abstract

Resumo: A descrição da penicilina revelou que microrganismos eram a fonte primária de muitos produtos naturais com aplicações farmacológicas. Sua bem-sucedida adoção medicamentosa foi seguida por um período prolífico de isolamento de novas drogas obtidas a partir de microrganismos encontrados no ambiente. Entretanto, a velocidade de novas descobertas diminuiu quando se observou que a grande maioria dos microrganismos não era prontamente cultivável em condições laboratoriais, ao mesmo tempo em que os organismos patogênicos alvo das drogas que vinham sendo usadas desenvolviam resistência. Logo ficou evidente que a empreitada deveria buscar novas estratégias. Pesquisadores passaram a estudar novas classes de metabólitos secundários, entre os quais chamou a atenção os produtos das sintetases de peptídeos não-ribossomais (NRPS) e sintases de policetídeos (PKS). Os módulos que compõem esses sistemas enzimáticos são formados por alguns domínios básicos e outros opcionais, que a partir de precursores simples - aminoácidos e acetato, respectivamente - são capazes de sintetizar moléculas com grande variedade estrutural, muitas com atividade biológica igualmente diversa. Outra frente de investigação se aproveitou dos avanços nas técnicas de isolamento e pesquisa independente de cultivo para explorar ambientes antes negligenciados, como o mar, que logo revelou hospedar uma nova gama de microrganismos e produtos derivados. Além de informações funcionais específicas, a exploração eficiente e sustentável desses ambientes exige uma melhor caracterização de suas comunidades microbianas; microrganismos são componentes essenciais de seu funcionamento, mas essa literatura ainda é escassa. Em virtude disso, esse trabalho propôs a investigação do microbioma de sedimentos de mangue da região da Baía de Paranaguá, Paraná, Brasil, através de metagenômica. No primeiro capítulo, usamos técnicas de sequenciamento de amplicons gerados a partir do gene de rRNA 16S para caracterizar a comunidade presente e determinar os fatores ambientais que moldam essa estrutura. Encontramos um predomínio dos filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Chloroflexi e Acidobacteria, quase todos significativamente afetando as estruturas intralocais. As classes mais abundantes foram Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria e Alphaproteobacteria. Revelamos forte influência da composição química derivada da proximidade do mar, sendo os fatores pH (SMP), H++Al3+, Ca2+, Mg2+, Na+, T, P, Na% e Ca/Mg significativos, mas não encontramos efeito de presença de planta, possibilidade descrita na literatura. Comparamos essa comunidade com a de outros mangues e encontramos similaridades que apontam para um perfil característico dependente de bioma, dominado pelos mesmo filos abundantes encontrados no mangue paranaense. No segundo capítulo, realizamos o sequenciamento shotgun de duas amostras do mangue pertencentes a localizações quimicamente diversas para determinar seu perfil funcional. As funções prevalentes eram relacionadas a subsistemas baseados em formação de cluster, carboidratos, aminoácidos e derivados, e funções variadas. Em níveis hierárquicos mais baixos, a abundância relativa de funções é geralmente balanceada. As diferenças funcionais também se mostraram dependentes de fatores ambientais, mas essa influência é menor do que no perfil taxonômico, o que indica resiliência funcional frente a alterações externas. As similaridades do mangue frente a outros biomas se mostraram mais dependentes de tipo de matriz (onde solo > água) do que de composição química (onde salina > não-salina); as dissimilaridades funcionais também foram menores que as taxonômicas, mas sua intensidade manteve relação com o grau de diferença de ambiente. No terceiro capítulo, o sequenciamento e processamento de amplicons provindos dos domínios A e C de enzimas NRPS, e KS de enzimas PKS, confirmou o mangue estudado como fonte potencial de metabólitos secundários. As medidas de diversidade não mostraram um padrão entre domínios enzimáticos, mas sugerem os melhores grupos para prospecção: verão | localização B para domínios A, inverno | localização B para domínios C, e inverno | localização A para domínios KS. Apesar de muitas sequências encontradas terem sido taxonomicamente afiliadas a gêneros reportadamente envolvidos na síntese desses metabólitos secundários, a descoberta de novos produtores é esperada dado o número de OTUs reportados e a presença de muitas sequências relacionadas a bactérias não caracterizadas. Os resultados apresentados devem servir de base para futuros estudos de prospecção direcionada.

Abstract: The description of penicillin revealed that microorganisms were the primary source of many natural products with pharmacological application. Its successful adoption as a medicament was followed by a prolific period in the isolation of new drugs obtained from microorganisms found in the environment. However, the pace of new discoveries decreased when it was noticed that the vast majority of microorganisms was not readily cultivable in laboratorial conditions, while the pathogenic organisms targeted by drugs in use developed resistance. It soon became evident that the enterprise should try new strategies. Researchers started studying new classes of secondary metabolites, among which much attention was given to the products of non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS). The modules building these enzymatic systems are formed by some basic and optional domains, which, from simple precursors - amino acids and acetate, respectively - are able to synthetize molecules with an incredible structural variety, many with equality diverse biological activity. Another front of investigation took advantage of the advances in isolation and cultivation-independent research techniques to explore environments previously neglected, like the ocean, which soon revealed to host a whole new range of microorganisms and derived products. Besides specific functional information, the efficient and sustainable exploration of such environments demands a better characterization of their microbial communities; microorganisms are essential components of their functioning, yet this literature is scarce. Following from these, this work proposed investigating the microbiome of mangrove sediments from the region of Paranaguá Bay, Paraná, Brazil, through metagenomics. In the first chapter, we used 16S rRNA gene-amplicon sequencing to characterize the community present and to determine the environmental factors shaping this structure. We found a predominance of phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Chloroflexi and Acidobacteria, almost all significantly affecting the intralocal structures. The most abundant classes were Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria. We revealed a strong influence of the chemical composition derived from the proximity to sea, being significant the factors pH (SMP), H++Al3+, Ca2+, Mg2+, Na+, T, P, Na% and Ca/Mg, but we found no plant effect, a possibility described in the literature. We compared this community with those of other mangroves and found similarities that point to a biome-dependent characteristic profile, dominated by the same abundant phyla found in the mangrove from Paraná. In the second chapter, we performed the shotgun sequencing of two mangrove samples from different environments to determine their functional profile. Prevailing functions were related to clustering-based subsystems, carbohydrates, amino acids and derivatives, and miscellaneous functions. In lowest hierarchy levels, the relative abundance of functions is generally balanced. The functional differences were also dependent on environmental factors, but this influence was smaller than in the taxonomic profile, which indicates functional resilience in front of external changes. The similarities of mangroves to other biomes were more dependent on matrix type (where soil > water) than on chemical composition (where saline > nonsaline); the functional dissimilarities were also smaller than the taxonomical, but the intensity kept its relation to the degree of environmental difference. In the third chapter, sequencing and processing of amplicons derived from A and C domains from NRPS, and KS from PKS, confirmed the studied mangrove as a potential source of secondary metabolites. The diversity measures showed no pattern among the enzymatic domains, but suggest the most suitable groups for prospection: summer | location B for A domains, winter | location B for C domains, and winter | location A for KS domains. Even though many sequences were taxonomically affiliated to genera reportedly involved in the production of such secondary metabolites, the discovery of new producers is expected given the number of OTUs reported and the presence of many sequences affiliated to uncharacterized bacteria. The results presented will be the basis for future studies of directed prospection.