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dc.contributor.advisorVeiga, Silvio Sanches, 1962-pt_BR
dc.contributor.otherChaim, Olga Meiript_BR
dc.contributor.otherUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecularpt_BR
dc.creatorVuitika, Larissapt_BR
dc.date.accessioned2022-12-19T19:05:49Z
dc.date.available2022-12-19T19:05:49Z
dc.date.issued2016pt_BR
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/1884/45388
dc.descriptionOrientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veigapt_BR
dc.descriptionCoorientador : Prof. Dr. Olga Meiri Chaimpt_BR
dc.descriptionTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/02/2016pt_BR
dc.descriptionInclui referências : f. 33-34;53-61pt_BR
dc.descriptionÁrea de concentração :Biologia Celular e Molecularpt_BR
dc.description.abstractResumo: Os membros da família das fosfolipases D, também referidas como toxinas dermonecróticas, estão entre as moléculas mais bem estudadas presentes no veneno de aranhas-marrons do gênero Loxosceles. Estas toxinas são biologicamente ativas, uma vez que induzem dermonecrose, resposta inflamatória exacerbada, agregação plaquetária, hemólise e insuficiência renal aguda. Apesar da sua importância biomédica, o papel dos resíduos de aminoácidos abrangendo a interface catalítica na atividade das fosfolipases D e seus efeitos biológicos ainda não estão totalmente esclarecidos. Para abordar esta questão, foi realizada uma investigação mutacional e funcional utilizando a isoforma LiRecDT1 (primeira isoforma de fosfolipase D identificada de Loxosceles intermedia) como modelo. As formas mutadas H12A, H12A-H47A e E32A-D34A (sítio catalítico), C53A-C201A (ponte dissulfeto adicional), K93A, Y228A e W230A (ligação ao substrato lipídico) e G96A (controle) foram produzidos em modelos heterólogos e purificados. Todas as variantes mutantes foram reconhecidas pelos anticorpos policlonais anti-veneno total e anti-LiRecDT1, mostrando que mantiveram os epítopos imunogênicos conservados. Além disso, observamos que a conformação das variantes mutantes permaneceu semelhante a isoforma original, mostrada pelo dicroismo circular (CD) e calorimetria diferencial de varredura (DSC). As variantes H12A, H12A-H47A e E32A-D34A apresentaram atividade fosfolipásica, hemolítica, alteração da permeabilidade vascular e dermonecrótica diminuídas para valores residuais, reforçando a participação desses resíduos na atividade catalítica. O maior destaque foi para a mutação no resíduo Y228, que se mostrou igualmente importante para as atividades bioquímicas e biológicas, indicando um papel essencial no reconhecimento e ligação ao substrato. Por outro lado, a variante mutante C53A-C201A (mutação que suprime a ponte dissulfeto adicional nas fosfolipases D de classe II) não bloqueou a atividade fosfolipásica, hemolítica, permeabilidade vascular e dermonecrótica em comparação com a LiRecDT1. Estes resultados confirmam os determinantes estruturais envolvidos com as atividades biológicas das fosfolipases D do veneno de aranhas-marrons, abrindo portas para pesquisas de estrutura/função por método de cristalografia, estudos de vias sinalização celular e mediadores pró-inflamatórios, e também na prospecção de inibidores moleculares específicos para estas enzimas. Palavras-chave: aranha-marrom, fosfolipase D, mutações sitio-dirigidas, atividade fosfolipásica.pt_BR
dc.description.abstractAbstract: Brown spider phospholipases D are among the most widely studied toxins in Loxosceles venom. These toxins are very active, as they induce dermonecrosis, exacerbated inflammatory responses, increased vascular permeability, hemolysis, and acute renal failure. Despite their biomedical importance, the role of residues at the catalytic interface of phospholipase D activity and other biological effects have not yet been determined. In the present study, a comprehensive mutational investigation was conducted using the Loxosceles intermedia phospholipase D (LiRecDT1) as model. All variants were identified using whole venom serum antibodies and a specific antibody to wild-type LiRecDT1 and showed native-like conformation according to circular dichroism (CD) and differential scanning calorimetry (DSC) analyses. The phospholipase activity of the variants H12A, H12A-H47A, and E32A-D34A, such as vascular permeability, dermonecrosis, and hemolytic effects were inhibited, suggesting the involvement of these residues in catalysis. The mutant Y228A was equally detrimental to biochemical and biological effects of phospholipase D, suggesting an essential role of this residue in substrate recognition and binding. On the other hand, the mutant C53A-C201A (which suppresses the hallmark disulfide bond of class II phospholipases D) did not block phospholipase activity, but compared to the wild-type LiRecDT1, the enzyme capacity to hydrolyze phospholipids and to promote dermonecrosis, hemolytic, and vascular effects was diminished. The results confirm the structural features of the biological activity of phospholipases D previously proposed by X-ray crystallographic studies, and leave open the possibility for the design of synthetic and specific inhibitors to Brown spider venom phospholipases D. Keywords: brown spider, venom, phospholipase D, site-directed mutagenesis, activity modulation.pt_BR
dc.format.extent62f. : il. algumas color., tabs., grafs.pt_BR
dc.format.mimetypeapplication/pdfpt_BR
dc.languagePortuguêspt_BR
dc.relationDisponível em formato digitalpt_BR
dc.subjectCitologia e biologia celularpt_BR
dc.subjectBiologia molecularpt_BR
dc.subjectFosfolipasespt_BR
dc.subjectAranhas - Venenopt_BR
dc.titleMapeamento estrutural do sítio ativo de fosfolipases D presente no veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia) : características bioquímicas e biológicaspt_BR
dc.typeTesept_BR


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