Otimização da produção de actinomicinas e potencial antimicrobiano e entomopatogênico de Streptomyces longwoodensis isolado da região entre-marés da Ilha do Mel, Pr, Brasil

Abstract

Resumo: Actinobactérias isoladas de regiões marinhas são um dos mais eficientes grupos produtores de metabólitos secundários. Muitos representantes da ordem Actinomycetales são prolíficos produtores de milhares de metabólitos secundários biologicamente ativos. Dessa forma, microorganismos que se desenvolvem e disseminam na região entre-máres apresentam processos fisiológicos e produção de metabólitos secundários complexos e particulares. Neste trabalho, após isolamento de compostos com potencial antimicrobiano, fez-se necessária a otimização da obtenção de substâncias ativas, em meio de cultivo, com o intuito de alcançar um maior rendimento do produto. Dessa forma, a biossíntese de antibióticos envolve um grande número de etapas até chegar na produção em maior escala. A partir da actinobactéria Gram positiva, isolado Streptomyces longwoodensis/Genbank: JX997145, obteve-se os metabólitos em meio Sabouraud líquido. Foram testadas concentrações de 10, 50, 100, 250 e 500 ?g/mL do extrato bruto com o objetivo de determinar a concentração inibitória mínima (MIC) contra as seguintes linhagens de referência: Candida albicans ATCC 10231 e bactérias como Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, e Staphylococcus aureus resistente. A análise dos resultados da macrodiluição indica que o extrato bruto possui potente atividade antimicrobiana contra S. aureus, MRSA e C. albicans. As MICs observadas foram de 50 ?g/mL para MRSA, 250 ?g/mL para S. aureus, e 500 ?g/mL para a C. albicans. A fim de otimizar a produção de biomassa da substância bioativa foi realizado um delineamento composto central (DCC). As melhores condições encontradas para a otimização da produção de biomassa foram: a temperatura de 30 °C; o tempo de cultivo 7,5 dias; o pH 5,2; dextrose 40 g/L e amido 40 g/L como fontes de carbono; extrato de levedura 10 g/L como fonte de nitrogênio. O caldo de fermentação foi submetido à técnicas cromatográficas diversas, utilizando-se solventes de polaridade adequada para o isolamento das substâncias de interesse. Os compostos isolados apresentam coloração alaranjada, são amorfos e solúveis em clorofórmio; os dados de ressonância magnética nuclear permitiram concluir que eles pertencem à classe das actinomicinas do complexo Z. Para avaliar os efeitos provenientes da interação entre as substâncias de interesse e uma linhagem celular, as células Vero (isolada a partir de tecido epitelial de rim de macaco) foram cultivadas em microplacas de 96 poços com duas séries de diluições dos compostos a diferentes concentrações, variando de 0,98-500 ?g/mL e 1 % de DMSO. Neste ensaio de citoxicidade realizado a amostra mostrou diferença significativa em relação ao controle, sem extrato, até a concentração mais baixa testada de 0,98 ?g/mL em células Vero para 96 h de incubação, apresentou um CC50 < 0,98 ?g/mL. Diante dos resultados obtidos neste ensaio preliminar, investigou-se a atividade biológica entomopatogênica. Os inseticidas químicos são amplamente utilizados na agricultura. No entanto, o uso excessivo destes químicos tem afetado a saúde humana, a poluição ambiental, danificando o ecossistema e favorecendo o desenvolvimento de resistência de organismos alvo como insetos e ácaros. A cultura da couve-manteiga (Brassica oleracea var. acephala) é acometida por infestações de diversas pragas, entre elas o pulgão Brevicoryne brassicae (Hemiptera: Aphididae). Dessa forma, o controle biológico por bactérias entomopatogênicas é uma alternativa viável e pode ser utilizada visando à redução no uso de inseticidas químicos. A CL50 de 0,32 × 106 UFC/mL obtida para S. longwoodensis é um indicativo de sua ação entomopatogênica. Assim como a redução na excreção de honeydew verificada para B. brassicae pode indicar ação fagodeterrente de S. longwoodensis. A actinobactéria isolada da região entre-marés apresenta potencial para produção de substâncias biologicamente ativas. Palavras-chave: Streptomyces, sedimento marinho, compostos bioativos, antimicrobiano, entomopatógeno, controle biológico

Abstract: Isolated actonomycetes of marine areas are one of the most efficient producers groups of secondary metabolites. Many representatives of the Actinomycetales order are prolific producers of thousands of biologically active secondary metabolites. Thus, microorganisms that develop and disseminate in the intertidal region have physiological processes and production complexes and particular secondary metabolites. In this work, after isolation of compounds with antimicrobial potential, it was necessary to optimize the achievement of active compounds in the culture medium in order to achieve a higher yield. Thus, the biosynthesis of antibiotics involves a number of steps to arrive at the larger scale production. From the Gram positive actinobacteria isolated Streptomyces longwoodensis/Genbank: JX997145, we obtained the metabolites in liquid Sabouraud. Extract concentrations were tested 10, 50, 100, 250 and 500 ?g/mL in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) against reference strains as follows: Candida albicans ATCC 10231 and bacteria such as Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and resistant Staphylococcus aureus. The analysis of macro-dilution results indicates that the crude extract has potent antimicrobial activity against S. aureus, MRSA and C. albicans. The MICs were observed from 50 ?g/mL for MRSA, 250 ?g/mL for S. aureus, and 500 ?g/mL for C. albicans. In order to optimize biomass production of bioactive substance was conducted a central composite design (CCD). The best conditions found for optimizing the production of biomass were: temperature 30 °C; the time cultivation 7.5 days; pH 5.2; dextrose 40 g/L and starch 40 g/L as carbon sources; yeast extract 10 g/L as nitrogen source. The fermentation broth was subjected to various chromatographic techniques, using suitable polar solvents for isolating substances of interest. The isolated compounds presented an orange color are amorphous and soluble in chloroform; nuclear magnetic ressonance data showed that they belong to the class of actinomycins complex Z. To evaluate the effects from the interaction between the substances of interest and a cell line, Vero cells (isolated from epithelial tissue of monkey kidney) were grown in 96 well microtiter plates with two fold serial dilutions of compounds at different concentrations ranging from 0.98 to 500 ?g/mL and 1 % DMSO. In this test, cytotoxicity results showed a statistically difference compared to the control without extract, to the lowest tested concentration of 0.98 ?g/mL in Vero cells for 96 h of incubation, presented a CC50 < 0.98 ?g/mL. Forward of results obtained in this preliminary study, we investigated the entomopathogenic biological activity. Chemical insecticides are widely used in agriculture. However, the excessive use of these chemicals has affected human health, environmental pollution, damaging the ecosystem and favoring the development of resistance of target organisms such as insects. The culture of kale (Brassica oleracea var acephala) is affected by infestations of various pests, including the aphid Brevicoryne brassicae (Hemiptera: Aphididae). Thus, the biological control by entomopathogenic bacteria is a viable alternative and can be used in order to reduce the use of chemical insecticides. The LC50 of 0.32 × 106 UFC/mL obtained to S. longwoodensis is indicative of its entomopathogenic action. As the reduction in excretion of honeydew observed for B. brassicae antifeedant activity may indicate S. longwoodensis action. Isolated actinobacteria from intertidal region has potential for production of biologically active substances. Keywords: Streptomyces, marine sediment, bioactive compounds, antimicrobial, entomopathogen, biological control