Desenvolvimento de sonda cadeado para diagnóstico molecular de Histoplasma capsulatum baseado na técnica de amplificação em círculo rolante (RCA)

Abstract

Resumo: Histoplasma capsulatum é um fungo dimórfico que cresce de forma filamentosa e produz hifas aéreas a temperaturas entre 25°C e 30°C, mas que sofre morfogênese para a fase leveduriforme a 37°C. Este fungo é considerado um importante patógeno e desenvolve-se em solos enriquecidos por excrementos de aves e morcegos, podendo ser isolado de ambientes onde vivem e se acumulam tais animais. A histoplasmose humana é causada por duas variedades do mesmo fungo, predominando H. capsulatum var. capsulatum nos Estados Unidos, América do Sul, Europa e alguns países da América Central e H. capsulatum var. duboisii nas regiões oeste e central da África. O espectro clínico da doença varia desde infecções assintomáticas à histoplasmose disseminada, podendo acometer tanto pacientes imunocomprometidos ou imunossuprimidos, quanto imunocompetentes. O diagnóstico convencional nem sempre é preciso, por isso são necessários métodos mais eficazes para a detecção de H. capsulatum em regiões endêmicas, onde o diagnóstico tardio da histoplasmose disseminada progressiva resulta em alta mortalidade. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma sonda cadeado para diagnóstico rápido de H. capsulatum com base na técnica de amplificação em círculo rolante (RCA). Sequências do espaçador interno transcrito (ITS) do DNAr de 177 linhagens de H. capsulatum foram usadas para projetar duas sondas cadeado a serem utilizadas para a detecção de polimorfismos de nucleotídeo único. Entre as duas sondas cadeado sintetizadas, uma mostrou ser 100% sensível e específica, quando testada em DNA de 29 amostras clínicas de H. capsulatum, não apresentando reação cruzada em amostras de DNA de 06 linhagens de fungos utilizadas como controles negativos (Aspergillus sp., Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Scedosporium sp. e Trichophyton sp.), além de DNA de Leishmania brasiliensis. Sendo assim, verificou-se que a sonda cadeado HcPL2 associada à técnica de RCA pode ser utilizada para o diagnóstico de H. capsulatum de maneira rápida e precisa, sendo uma importante proposta à substituição de técnicas de diagnóstico convencionais.

Abstract: Histoplasma capsulatum is a dimorphic fungus that grows in a filamentous form and produces aerial hyphae at temperatures between 25°C and 30°C, but undergoes morphogenesis for yeast phase at 37°C. This fungus is considered an important pathogen and develops in soils enriched by droppings of birds and bats, can be isolated from environments where live and accumulates such animals. Human histoplasmosis is caused by two strains of the same fungus, H. capsulatum var. capsulatum predominating in the United States, South America, Europe and some countries in Central America, and H. capsulatum var. duboisii in western and central Africa. The clinical spectrum of disease ranges from asymptomatic to disseminated histoplasmosis infections and can affect immunocompromised or immunosuppressed patients as immunocompetent. By presenting a conventional diagnosis often not accurate, more efficient methods are necessary to detect H. capsulatum in endemic regions, where the late diagnosis of progressive disseminated histoplasmosis results in high mortality. This study aimed to develop a padlock probe for rapid diagnosis of H. capsulatum based on the technique of rolling circle amplification (RCA). Sequences of the internal transcribed spacer (ITS) of 177 rDNA H. capsulatum strains were used to design two padlock probes to be used for detecting single nucleotide polymorphisms. Between the two padlock probes synthesized, one was found to be 100% sensitive and specific when tested on 29 clinical samples of DNA from H. capsulatum, showing no cross reaction with DNA samples from 06 strains of fungi used as negative control (Aspergillus sp., Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Scedosporium sp. and Trichophyton sp. and DNA from Leishmania brasiliensis. Therefore, it has been found that the padlock probe HcPL2 associated with RCA technique can be used to the diagnosis of H. capsulatum quickly and accurately, and is an important proposal to replace conventional diagnostic techniques.