Análise metabolômica de linhagens de melanócitos e melanomas de origem humana e murina

Abstract

Resumo: Biomarcadores capazes de diferenciar células tumorigênicas de não tumorigênicas são importantes, mas ainda existem em quantidades restritivas. Neste estudo, análises de RMN 2D do tipo HSQC-ed forneceram fingerprints dos extratos lipídicos obtidos de linhagens de melanoma humano, representando diferentes estágios de tumorigênese (RGP, VGP e MET), e linhagens de melanócitos e de melanoma de origem murina. Em relação às linhagens murinas, técnicas de análise multivariada demonstraram que o uso de agentes mitogênicos, como ésteres de forbol, podem influenciar significativamente o perfil lipidômico da linhagem de melanócitos, tornando-o mais semelhante ao perfil de linhagens de células mais proliferativas. Extratos aquosos também foram estudados e os metabólitos que mais influenciaram na discriminação entre as linhagens foram quantificados, esses dados, em conjunto com os obtidos da fração lipídica, permitiram caracterizar o metaboloma destas linhagens. A composição de ácidos graxos das linhagens celulares, analisada por GC-MS, foi diferenciada principalmente pelas proporções de ácidos graxos C14:0 e C16:0, em maior quantidade na linhagem de melanoma murino, e C18:1, presente em maior proporção na linhagem de melanócitos murina. Porém, a diferenciação das linhagens foi fortemente influenciada pelos metabólitos de baixo peso molecular creatina e creatinina. Análises de expressão gênica confirmaram que a via bioquímica deste metabólito está alterada entre as linhagens celulares. O lipidoma das linhagens de melanoma humano revelou que os ácidos graxos C14:0, C16:1, C18:0 e C20:4 aumentaram sua proporção nas linhagens com maior potencial tumorigênico (VGP e MET). Análises de GC-MS e de componentes principais apontaram derivados de inositol como os principais contribuintes para a diferenciação das linhagens, e análises de RMN 2D confirmaram que os níveis de lipídeos da classe dos fosfatidilinositóis possuem uma relação direta com o potencial tumorigênico das 3 linhagens de células de melanoma humanas analisadas. Os resultados demonstram que perfis lipidômicos podem ser utilizados para diferenciar linhagens de melanócitos de melanoma e também linhagens de melanomas em diferentes estágios de progressão do tumor, e a combinação das técnicas desenvolvidas pode fornecer novos métodos de diagnóstico e classificação deste carcinoma.

Abstract: Biomarkers that discriminate tumorigenic from normal cells are important but limited. In the present study, 2D HSQC-ed NMR lipid maps from human melanoma cell lines, having distinct tumorigenic potential (RGP, VGP and MET) and mouse melanocytes and melanoma cell lines were obtained. Regarding the mouse cell lines, we revealed through principal component analysis that the use of mitogenic agents, such as phorbol esters, can markedly influence the lipid profile of the melanocyte cell line, resembling the pattern of the most proliferative cell lines. Aqueous extracts were also characterized, and the metabolites that most indicated discrimination between the cell lines were quantified, allowing to characterize the metabolomic profile of the cell lines. The cell lines had different fatty acid compositions, as confirmed through GC-MS analysis, the melanocyte containing a lower proportion of C14:0 and C16:0, the opposite occurring with C18:1, when compared with the melanoma cell line, but the differentiation was mostly influenced to small-molecule metabolites: creatine and creatinine. Gene expression analysis confirmed that the synthetic pathway of these metabolites was altered between the cell lines. The human melanoma lipidome showed a fatty acid composition with C14:0, C16:1, C18:0 and C20:4 having a higher proportion on the VGP and MET cell lines than in RGP. Multivariate and GC-MS analysis pointed out inositol derivatives as main contributors to the differentiation of the cells, and 2D NMR analysis established that the levels of phosphoinositol derivatives are related to the carcinogenic stage of the 3 cell lines. These results demonstrate that lipidomic profiles were capable to discriminate melanocytes from melanoma cells and even melanomas on distinct tumorigenic stages. The combination of the applied techniques could be an efficient and convenient tool for early diagnosis and screening of melanoma disease.