Perfil epigenético dos genes CXCR4, CXCL12, ESR1, PGR e MMP2 envolvidos com o mecanismo molecular de metástase em câncer de mama.

Abstract

Resumo: O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Estima-se que 90% das causas de mortes são devido às metástases. Importantes moléculas estão envolvidas no processo metastático: as quimiocinas são moléculas envolvidas na sinalização e direcionamento dos sítios de metástases e os genes de receptores hormonais estão envolvidos na proliferação das células, enquanto proteases presentes no microambiente tumoral auxiliam na degradação dos constituintes da matriz. Os mecanismos epigenéticos, tais como metilação do DNA e a modificação das histonas estão envolvidos na regulação da expressão de vários genes envolvidos nas várias etapas deste processo. Sendo assim, os genes CXCR4, CXCL12, ESR1 e PGR foram avaliados por análise da metilação do DNA na região promotora e pela presença da proteína por imunohistoquímica em tumores primários de mama e adicionalmente, o gene MMP2 também foi avaliado por imunoprecipitação de cromatina em linhagem tumoral de mama sendo ao dados subdivididos em três artigos científicos. Os dados de metilação do DNA da região promotora de CXCR4 mostrou que 67% dos tumores primários de mama apresentaram a região analisada desmetilada, sendo esta característica associada ao estádio tumoral, tamanho, grau histológico, acometimento de linfonodos, metástase e morte das pacientes. Por outro lado, a hipermetilação do DNA da região promotora dos genes CXCL12 e ESR1 também apresentou significância. Análises estatísticas de sobrevida mostraram que o sincronismo entre a metilação de CXCL12 e a não metilação de CXCR4 é uma importante característica na sobrevida global e livre de doença, e contribui para pior prognóstico às pacientes. Os resultados de metilação específica por PCR (MSP) da região promotora destes genes poderiam auxiliar na avaliação da progressão de tumores de mama. Na prática clínica, a presença das proteínas do receptor de estrógeno (RE) e progesterona (RP) por imunohistoquímica contribui para um melhor prognóstico às pacientes e a ausência da expressão dos produtos destes dois genes se dá, em parte, pela hipermetilação do DNA na região promotora em carcinomas mamários. Cerca de 80% das pacientes com metástase e/ou morte apresentaram hipermetilação do DNA de ESR1 e/ou PGR e isto contribuiu para a pior sobrevida global e livre de doença. A presença da proteína MMP-2 foi avaliada em 44 amostras de tumores primários por imunohistoquímica. A compilação dos dados proteicos entre RE, RP e MMP-2, bem como a metilação de DNA da região promotora de ESR1 e PGR nas amostras tumorais mostraram que, a análise concomitante entre estas marcas poderiam contribuir na prática clínica na análise de sobrevida global e livre de doença das pacientes. Para confirmar o padrão de expressão de MMP-2, a região promotora do gene amplificada e clonada em diferentes linhagens celulares de mama. A ausência de expressão do transcrito de MMP2 na linhagem MCF7, e consequente expressão após ser tratada com o agente desmetilante 5-aza-2'-deoxicitidina (5-Aza) por 96h e com o inibidor de HADCs tricostatin A (TSA) por 16h confirmou a regulação epigenética de MMP2. O cultivo da linhagem tumoral de mama MCF7 com a fibronectina, uma importante proteína constituinte da matriz extracelular (MEC), além dos agentes citados, mostrou que houve uma variação do perfil de metilação global região promotora do gene MMP2 obtendo os resultados de 90% de metilação quando tratada com 5-Aza, 86% com TSA e 61% com fibronectina após 5h. A interação da célula com a proteína por si só foi capaz de estimular a desmetilação da região promotora de MMP2 em 30% no valor global da percentagem de metilação do DNA, assim como o observado com os agentes químicos. Nenhuma migração ou invasão da células foi observada. Após a retirada da fibronectina a linhagem MCF7 foi recultivada por 48h. Os resultados de qPCR e sequenciamento mostraram que o processo de desmetilação de MMP2 é um mecanismo rápido, dinâmico e transitório e este é o primeiro dado da literatura que mostra que a interação entre a célula tumoral e um constituinte da MEC é capaz de promover a desmetilação de genes associados ao processo metastático. Ensaios de imunoprecipitação de cromatina com a linhagem não mostraram diferenças entre as histonas de silenciamento gênico H3K9me3 e H3K27me3, mas observou-se um aumento da marca de abertura de transcrição da histona H3K4me3 na região promotora do gene MMP2 após o cultivo com fibronectina por 5h (p < 0,001). Assim, o conjunto de dados obtidos com estes cinco genes reforçam que são necessárias diversas ferramentas metodológicas quando se envolve a progressão de tumores de mama. As diferentes conjecturas entre as moléculas envolvidas no processo de tumorigênese e como isto pode contribuir para a qualidade de vida da paciente tende ainda mais a um processo de análise individual do doente, capaz de auxiliar e anteceder o prognóstico das pacientes com câncer de mama.