Monitoramento de Azospirillum brasilense e estudo da diversidade bacteriana associada a raízes de trigo (Triticum aestivum)

Abstract

Resumo: O reconhecimento da importância da biologia do solo e da busca de alternativas para diminuir o consumo de fertilizantes nitrogenados ampliou as pesquisas na área de fixação biológica de nitrogênio. O efeito da bactéria Azospirillum sp. no desenvolvimento das plantas tem sido pesquisado, não somente quanto ao rendimento das culturas mas, também, com relação às causas fisiológicas que, possivelmente, aumentam esse rendimento. Contudo, ainda são necessários estudos sobre os efeitos da inoculação destes microrganismos na diversidade microbiana do solo e da planta. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi determinar a diversidade bacteriana associada à cultura do trigo submetido a diferentes tratamentos e inoculação com a estirpe de Azospirillum brasilense FP2 e monitorar a população da bactéria inoculada. Um protocolo otimizado para análise de microrganismos por espectrometria de massa MALDI-TOF foi desenvolvido. Bactérias das raízes de trigo foram isoladas e então analisadas por espectrometria de massa MALDI-TOF para agrupamento a partir do perfil de m/z obtidos. Representantes de cada grupo foram identificados por seqüenciamento do gene 16S rRNA. A análise dos grupos obtidos por espectrometria de massa mostrou que a inoculação com A. brasilense afetou a composição da microbiota associada à raiz, sendo a maioria das espécies identificadas nas plantas inoculadas diferentes das plantas não inoculadas. O grupo mais abundante de bactérias isoladas é do gênero Pseudomonas sp. A bactéria A. brasilense não foi recuperada entre os isolados. A metodologia para a identificação de microrganismos por espectrometria de massa MALDI-TOF desenvolvida neste trabalho é muito útil para estudos de diversidade de microrganismos isolados. A técnica de Hibridização Fluorescente in situ foi utilizada para observar a colonização de A. brasilense FP2 em condições estéreis e não estéreis em raízes de trigo. Oligonucleotídeos específicos para a estirpe de A. brasilense FP2 foram desenhados e um protocolo para a quantificação deste organismo por qPCR foi desenvolvido. Esta quantificação foi realizada em condições estéreis, não estéreis e sob competição com os organismos A. brasilense NH, Herbaspirillum seropedicae Z67, Gluconacetobacter diazotrophicus DSM 5601 e A. lipoferum DSM 1691, todos com concentração final de 107 UFC/planta. A comparação entre a quantificação da bactéria inoculada por qPCR e contagem em placa mostrou resultados similares. A contagem de A. brasilense FP2 inoculado não apresentou uma redução significativa indicando que esta bactéria é competitiva, mantendo uma alta contagem de células mesmo com a crescente competição imposta nos experimentos. A metodologia de qPCR desenvolvida neste trabalho é uma ferramenta muito útil no monitoramento da dinâmica da população da bactéria inoculada com potencial aplicação no campo.