Estudo da regulação da atividade da proteína NifA de Herbaspirillum seropedicae em resposta aos níveis de amônio e oxigênio

Abstract

Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio capaz de se associar a plantas com interesse econômico. A proteína NifA desse organismo é responsável por regular a síntese das proteínas de estrutura e montagem do complexo enzimático da nitrogenase. A atividade da proteína NifA é regulada por dois sinais ambientais: oxigênio molecular e nitrogênio fixado. O sítio de sensibilidade ao oxigênio é provavelmente um motivo de cisteínas, que é conservado apenas em proteínas NifA sensíveis ao oxigênio. A sensibilidade ao nitrogênio fixado está relacionada com a inibição da atividade da proteína pelo seu domínio N-terminal GAF. O exato mecanismo de inibição da atividade da proteína NifA por esses dois sinais ambientais ainda é desconhecido. O presente trabalho teve por objetivo fornecer dados que auxiliem o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na regulação da atividade da proteína NifA de H. seropedicae. Para esclarecer o papel do motivo conservado de cisteínas da proteína NifA, a tividade de ligação ao DNA in vitro de uma série de mutantes pontuais neste motivo foi testada. Esse experimento demonstrou que esse motivo não está relacionado com a ligação da proteína ao DNA promotor. Com o emprego de proteínas quiméricas observou-se que o domínio N-terminal GAF da proteína NifA de H.seropedicae não está relacionado com a sensibilidade ao oxigênio, mas sim com nitrogênio fixado. Além disso, foi demonstrado que a proteína GlnK é responsável por transduzir os níveis de nitrogênio fixado para o domínio N-terminal GAF por interação direta proteína-proteína. A avaliação do efeito de efetores metabólicos na formação do complexo GAF/GlnK mostrou que o aumento na concentração de 2-OG pode desestabilizá-lo. Foi avaliado ainda o efeito dos efetores metabólicos na estrutura secundária da proteína GlnK. Utilizando a técnica de ITC foi possível determinar as constantes de afinidade da proteína GlnK de H. seropedicae pelos efetores metabólicos. Com os resultados aqui apresentados foi possível elaborar um modelo de regulação da atividade da proteína NifA de H. seropedicae pelos níveis de nitrogênio fixado e melhorar o entendimento sobre o papel do motivo conservado de cisteínas na atividade da proteína.