Avaliação da eficácia dos esporos do fungo Clonostachys rosea e caracterização bioquímica e estrutural de seus polissacarídeos

Abstract

O fungo Clonostachys rosea é um agente de controle biológico contra fungos fitopatogênicos, insetos e nematóides. Esta tese tem duas vertentes relacionadas à ação de biocontrole de C. rosea: um estudo completo para o desenvolvimento de um produto de biocontrole com base nos seus esporos e um estudo dos carboidratos extraídos da sua parede celular e liberados no meio de cultivo. Em relação ao produto de biocontrole, foram feitas três fermentações em estado sólido (FES), utilizando arroz como substrato: FES-1, FES-2 e FES-3. Durante a fermentação, os frascos de FES-1 e FES-2 foram fechados com tampão de algodão e os frascos de FES-3, com papel higiênico. Após a fermentação, FES-1 foi submetida a uma secagem branda. O arroz colonizado proveniente de cada FES foi submetido a três processos de formulação antes do armazenamento: no tratamento C não foi aplicado nenhum processo, no tratamento T o arroz foi triturado e no tratamento M o arroz foi triturado e misturado com amido de milho. Cada formulação foi armazenada em duas condições: temperatura ambiente e 4 ºC. A avaliação dos tratamentos foi feita por testes de viabilidade e de eficácia dos esporos durante 150 dias de armazenamento. A viabilidade dos esporos diminuiu em todos os tratamentos durante o armazenamento. A velocidade da perda foi menor nos tratamentos armazenados a 4 ºC. O índice de contaminação foi baixo em FES-3 e FES-1. Ao contrário, FES-2 apresentou alto índice de contaminação devido ao elevado teor de umidade do arroz colonizado. Os tratamentos C e M da FES-3, armazenados a 4 ºC, apresentaram os melhores resultados, com viabilidade dos esporos superior a 80% após 150 dias. A eficácia dos esporos foi avaliada através de um teste de titulação. Seu objetivo foi determinar o titer, isto é, a menor concentração de esporos de C. rosea capaz de reprimir totalmente o crescimento de Botrytis cinerea em uma placa. Os resultados deste teste apresentaram boa correlação com os resultados de germinação de esporos, tornando esse sistema de avaliação um protocolo factível para o estudo da interação entre fungos. Em relação ao estudo dos carboidratos, foi feita a purificação e a caracterização química de galactomananas de C. rosea, encontradas na biomassa e no caldo de cultivo de uma fermentação líquida de superfície. As galactomananas apresentaram proporções molares de Man, Gal e Glc praticamente idênticas, sendo 25:47:28 para o polissacarídeo da biomassa e 23:48:29 para o polissacarídeo do caldo de cultivo. A similaridade foi confirmada por espectros de RMN-1H, RMN-13C, HMQC e COSY. Foi proposto que a galactomanana encontrada no caldo de cultivo teve origem a partir da autólise da biomassa, baseado não somente na similaridade com a galactomanana extraída da biomassa, mas também no fato de que sua concentração aumentou rapidamente após depleção da glucose do meio de cultivo, enquanto a concentração de biomassa diminuiu. Polissacarídeos de C. rosea não foram caracterizados previamente, mas este trabalho mostrou que as características das galactomananas de C. rosea são consistentes com aquelas relatadas para outros membros da família Bionectriaceae, a família a que C. rosea pertence.

The fungus Clonostachys rosea is a biological control agent effective against phytopathogenic fungi, insects and nematodes. Two studies related to the biological control activity of C. rosea were undertaken: a study to develop a biocontrol product based on the spores of this fungus and a study of the polysaccharides of the cell wall. In relation to the biocontrol product, three solid-state fermentations (FES) were undertaken, using rice as a substrate: FES-1, FES-2 and FES-3. During the fermentations FES-1 and FES-2 the flasks were closed with cotton wool plugs while those of FES-3 were closed with tissue paper. After the fermentation, FES-1 was dried under mild conditions. The colonized rice from each of the three solid-state fermentations was submitted to three different formulation processes before storage: In treatment C no additional processing was undertaken, in treatment T the rice was ground and in treatment M the rice was ground and mixed with corn starch. Each formulation was stored at room temperature and at 4°C. The treatments were evaluated on the basis of a viability test and a test of spore efficacy, during 150 days of storage. The viability of the spores decreased during storage for all preparations and conditions. The velocity of loss of viability was lower in the preparations that were stored at 4°C. The frequency of contamination was low for preparations FES-1 and FES-3. On the contrary, the preparation FES-2 suffered from a high rate of contamination, due to the high water content of the fermented rice. Treatments C and M of the preparation FES-3, stored at 4°C, gave the best results, with spore viabilities remaining above 80% over the 150 days of storage. The spore efficacy was evaluated based on a titration test. The objective of this test was to determine the titer, that is, the lowest concentration of spores of C. rosea that was able to repress totally the growth of Botrytis cinerea on an agar plate. The results of this test correlated well with the results of the spore viability test, indicating that this titration test can be used for the study of interaction between a biocontrol fungus and its fungal target. In relation to the study of the cell wall polysaccharides of C. rosea, two galactomannans were purified and characterized from a surface liquid culture, one from the biomass and one from the fermentation broth. These two galactomannas had nearly identical molar proportions of Man, Gal and Glc and their similarity were confirmed by RMN-1H, RMN-13C, HMQC and COSY spectra. It was proposed that the galactomannan found in the fermentation broth originated from the autolysis of the biomass, based not only on its similarity with the galactomannan extracted from the biomass, but also on the fact that its concentration increased rapidly after the exhaustion of glucose form the medium, when the concentration of biomass was decreasing. Polysaccharides of C. rosea have not been characterized previously, but this work demonstrated that the galactomannans of C. rosea are similar to those that have been reported for other members of the Bionectriaceae, the family to which C. rosea belongs.