Método de inoculação de Colletotrichum nymphaeae (Pass.) Aa para avaliação da resistência de genótipos de erva-mate à antracnose

Abstract

Resumo: A erva-mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) possui relevância econômica e social na região Sul do Brasil, porém enfrenta limitações fitossanitárias decorrentes da antracnose, causada por Colletotrichum nymphaeae. A ausência de fungicidas registrados para a cultura e a falta de cultivares com resistência conhecida dificultam o manejo da doença. Nesse contexto, o desenvolvimento de programas de melhoramento genético voltados à resistência depende do estabelecimento de protocolos de inoculação padronizados para este patossistema. O presente trabalho teve como objetivos caracterizar aspectos fisiológicos de isolados de C. nymphaeae e desenvolver um método de inoculação em folhas destacadas para avaliação da resistência de genótipos de erva-mate à antracnose. Foram avaliados o crescimento micelial e a esporulação dos isolados RS7 e RS10 em sete meios de cultura, bem como a germinação de conídios em função do tempo e da temperatura. Para o protocolo de inoculação, folhas destacadas de genótipos clonais, BRS 408 e BRS 409, e de material seminal foram submetidas à desinfestação com peróxido de hidrogênio e tratamento antioxidante. Dois métodos de inoculação com ferimento foram comparados: disco de micélio-BDA (DMBDA) e disco de papel filtro (DF) embebido em suspensão de 106 conídios/mL. As folhas foram incubadas a 24 °C, e a proporção de área foliar lesionada foi quantificada por análise de imagens digitais, com confirmação etiológica por reisolamento. Os meios BDA, cenoura-ágar e Mathur proporcionaram os maiores valores de crescimento micelial, enquanto o meio cenoura-ágar promoveu a maior esporulação para ambos os isolados. Os pontos máximos estimados de germinação ocorreram a 21,4 °C para RS7 e 21,7 °C para RS10, com tempos de máxima germinação de 11,3 h e 13,7 h, respectivamente, evidenciando variabilidade intraespecífica. O método DMBDA apresentou contaminação por fungos em folhas inoculadas e controles, sendo considerado inadequado para o ensaio. O método DF mostrou-se mais controlado e permitiu o reisolamento de C. nymphaeae. Não foram detectadas diferenças significativas na proporção de área foliar lesionada entre os genótipos avaliados nas condições experimentais. Conclui-se que os meios BDA, cenoura-ágar e Mathur são adequados para o cultivo de C. nymphaeae, com destaque para o cenoura-ágar na produção de inóculo, e que o método DF é mais apropriado que o DMBDA para inoculação de C. nymphaeae em folhas destacadas de erva-mate. A principal contribuição deste trabalho é o método proposto, cuja aplicação para discriminação de genótipos resistentes requer refinamentos adicionais, incluindo ampliação do período de incubação e maior controle da variabilidade experimental

Abstract: Yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) has economic and social relevance in southern Brazil; however, it faces phytosanitary limitations due to anthracnose, caused by Colletotrichum nymphaeae. The absence of registered fungicides for this crop and the lack of cultivars with known resistance hinder disease management. In this context, the development of breeding programs aimed at resistance depends on the establishment of standardized inoculation protocols for this pathosystem. This study aimed to characterize physiological aspects of C. nymphaeae isolates and to develop a detached-leaf inoculation method for evaluating the resistance of yerba mate genotypes to anthracnose. Mycelial growth and sporulation of isolates RS7 and RS10 were evaluated on seven culture media, as well as conidial germination as a function of time and temperature. For the inoculation protocol, detached leaves from clonal genotypes, BRS 408 and BRS 409, and seedling material were subjected to disinfestation with hydrogen peroxide and antioxidant treatment. Two wound-inoculation methods were compared: mycelium-PDA disc (MPDA) and filter paper disc (FP) soaked in a 106 conidia/mL suspension. Leaves were incubated at 24 °C, and the proportion of lesioned leaf area was quantified by digital image analysis, with etiological confirmation by re-isolation. PDA, carrot agar, and Mathur media provided the highest mycelial growth values, whereas carrot agar promoted the highest sporulation for both isolates. The estimated maximum germination points occurred at 21.4 °C for RS7 and 21.7 °C for RS10, with times to maximum germination of 11.3 h and 13.7 h, respectively, indicating intraspecific variability. The MPDA method showed fungal contamination in both inoculated and control leaves and was therefore considered unsuitable for the assay. The FP method proved to be more controlled and allowed the re-isolation of C. nymphaeae. No significant differences in the proportion of lesioned leaf area were detected among the genotypes evaluated under the experimental conditions. It is concluded that PDA, carrot agar, and Mathur media are suitable for cultivating C. nymphaeae, with carrot agar standing out for inoculum production, and that the FP method is more appropriate than MPDA for inoculating C. nymphaeae on detached yerba mate leaves. The main contribution of this work is the proposed method, whose application for discriminating resistant genotypes requires further refinements, including extension of the incubation period and greater control of experimental variability