Tupanvirus induz a liberação de nets em neutrófilos humanos : caracterização das vias de sinalização

Abstract

Resumo: Neste trabalho demonstramos que a presença de tupanvirus, um vírus gigante da família Mimiviridae, é capaz de induzir a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) por neutrófilos humanos. A incubação de diferentes multiplicidades de infecção (MOIs) do vírus por 2 horas promoveu liberação significativa de NETs, com leve redução da viabilidade celular, enquanto o tratamento das células com o vírus tupanvirus tratado por UV também resultou nesta redução, indicando que componentes estruturais virais são suficientes para ativar a resposta. A caracterização morfológica das NETs por imunofluorescência confirmou a presença de estruturas extracelulares de DNA associadas à elastase neutrofílica, além da colocalização do vírus com as redes, evidenciando seu aprisionamento pelas mesmas. Investigando os mecanismos de ativação, observamos que a inibição do receptor celular do tipo Toll 4 (TLR4) bloqueou a liberação de NETs induzida pelo tratamento com tupanvirus, enquanto TLR2 não apresentou participação, mostrando que a resposta depende especificamente da ativação de TLR4. O tratamento com tupanvirus induziu produção significativa de espécies reativas de oxigênio (ROS); porém, a inibição dessas espécies reativas não impediu a formação de NETs, indicando que a via ativada é independente de ROS. Por outro lado, o bloqueio da fagocitose reduziu parcialmente a NETose induzida pelo tratamento com o vírus, sugerindo contribuição desse processo. Além disso, a inibição da peptidil arginina deiminase 4 (PAD4) e do cálcio citosólico suprimiu a formação de NETs, demonstrando que ambos são essenciais para esse mecanismo induzido pelo tupanvirus. Em contraste, a inibição de elastase neutrofílica e mieloperoxidase (MPO) não afetou a liberação de NETs, reforçando que essas enzimas não participam dessa via específica de ativação

Abstract: In this study, we demonstrate that presence of tupanvirus, a giant virus of the Mimiviridae family, can induce the formation of neutrophil extracellular traps (NET) by human neutrophils. Incubation with different multiplicities of infection (MOIs) of the virus for 2 hours resulted in significant NET release, accompanied by a slight reduction in cell viability. Incubation of these cells with UV-treated tupanvirus also induced such reduction, indicating that viral structural components are sufficient to trigger the response. Morphological characterization by immunofluorescence confirmed the presence of extracellular DNA structures associated with neutrophil elastase, as well as the colocalization of the virus with these networks, evidencing its entrapment within the NET. Investigating the activation mechanisms, we observed that inhibition of tolllike receptor 4 (TLR4) blocked NET release induced by tupanvirus, while TLR2 showed no involvement, demonstrating that the response specifically depends on TLR4 activation. Tupanvirus induced significant reactive oxygen species (ROS) production; however, inhibition of these reactive species did not prevent NET formation, indicating that the activated pathway is ROS-independent. In contrast, phagocytosis blockade partially reduced virus-induced NETosis, suggesting a contribution of this process. Additionally, inhibition of peptidyl arginine deiminase (PAD4) and cytosolic calcium suppressed NET formation, demonstrating that both are essential for this tupanvirusinduced mechanism. Conversely, inhibition of neutrophil elastase and myeloperoxidase (MPO) did not affect NET release, reinforcing that these enzymes do not participate in this specific activation pathway