Estudo dos mecanismos envolvidos na permeabilidade vascular relacionada à toxicidade urêmica

Abstract

Resumo: A disfunção endotelial é frequente em pacientes com doença renal crônica (DRC) e pode resultar na perda de junções intercelulares e assim contribuir para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV). O objetivo do presente estudo foi investigar in vivo e in vitro o impacto do ambiente urêmico na permeabilidade vascular. Para tanto, foram coletados soros de 80 pacientes em diferentes estágios de DRC. Foram dosados os níveis séricos das toxinas urêmicas p-cresil sulfato (PCS), indoxil sulfato (IS) e fosfato (Pi) e dos biomarcadores inflamatórios Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP 1), Interleukin 8 (IL-8), Intercellular Adhesion Molecule 1 solúvel (ICAM-1s) e Vascular Cell Adhesion Molecule 1 solúvel (VCAM-1s). Em outra coorte, foram avaliadas a expressão de Vascular Endothelial Cadherin (VE-caderina) e Zonula occludens-1 (ZO-1) em artérias ilíacas e renais de pacientes com DRC (receptores) e de doadores (controles), coletados durante transplante renal. In vitro, células endoteliais humanas foram tratadas com PCS, IS e Pi nas concentrações máximas urêmicas e com pool de soros dos pacientes, agrupados em diferentes estágios de uremia. A viabilidade, permeabilidade e morfologia celular foram avaliadas por MTT, transwell e microscopia eletrônica de varredura (MEV), respectivamente. As expressões gênicas de VE-caderina e ZO-1 foram avaliadas por RT-qPCR e as expressões proteicas por Western Blot, imunofluorescência e citometria de fluxo. In vivo, MCP-1, VCAM-1s, PCR-US e todas as toxinas testadas correlacionaram-se significativamente com a TFG (P<0,001; P<0,0001; P<0,01 e P<0,0001). Nas artérias de doadores observou-se um endotélio intacto formando uma monocamada contínua com forte expressão de VE-caderina e ZO-1, o que não foi observado nas artérias de receptores. In vitro, houve um aumento significativo na permeabilidade celular, especialmente em células tratadas com Pi e pools urêmicos (P<0,001). Através da MEV, observou-se que dentre as três toxinas testadas, Pi é a que induz maior perda de junção intercelular, semelhante ao efeito do soro urêmico em estágios mais severos de DRC. A expressão gênica e proteica de VE-caderina diminuíram significativamente (P<0,01), especialmente em células tratadas com Pi3 e todos os grupos urêmicos. Por outro lado, na análise de ZO-1, percebeu-se que embora a expressão gênica esteja significativamente aumentada (P<0,01), a expressão proteica está diminuída (P<0,05). Em resumo, demonstrou-se in vivo e in vitro que a uremia afeta as junções endoteliais, e quanto mais avançada a DRC, mais comprometimento endotelial. O impacto da uremia na expressão de VE-caderina e ZO-1 é mais significativo nos estágios moderado e severo da DRC e é distinto quando analisado separadamente cada toxina ou os soros urêmicos, o que sugere diferentes mecanismos fisiopatológicos. In vitro, demonstrou-se que a expressão gênica e proteica de VE-caderina estão diminuídos em estágios mais avançados de DRC. Entretanto, observou-se uma maior expressão gênica de ZO-1, porém uma menor expressão proteica, o que sugere uma possível regulação pós-transcricional e um papel regulador dessa proteína. Nosso estudo abre perspectivas para avaliar o envolvimento de inúmeras proteínas de junções intercelulares, a fim de elucidar a relação da uremia com a disfunção endotelial e permeabilidade vascular

Abstract: Endothelial dysfunction is common in patients with chronic kidney disease (CKD) and may result in the loss of intercellular junctions and thus contribute to the development of cardiovascular disease (CVD). The aim of the present study was to investigate in vivo and in vitro the impact of the uremic environment on vascular permeability. For this, sera from 80 patients were collected at different stages of CKD. Serum levels of uremic toxins p-cresyl sulfate (PCS), indoxyl sulfate (IS) and phosphate (Pi) and the inflammatory biomarkers Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1), Interleukin 8 (IL-8), Intercellular Adhesion Molecule 1 soluble (ICAM-1s) and Vascular Cell Adhesion Molecule 1 soluble (VCAM-1s) were measured. In another cohort, the expression of Vascular Endothelial Cadherin (VE-cadherin) and Zonula occludens-1 (ZO-1) in the renal and iliac arteries of patients with CKD (receptors) and donors (controls) collected during renal transplantation were analyzed. In vitro, human endothelial cells were treated with PCS, IS and Pi at the maximum uremic and serum pool concentrations of patients, grouped at different stages of uremia. The viability, permeability and cellular morphology were evaluated by MTT, transwell and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The gene expression of VE-cadherin and ZO-1 were evaluated by RT-qPCR and the protein expression were evaluated by Western Blot, immunofluorescence and flow cytometry. In vivo, MCP-1, sVCAM-1, PCR-US and all toxins tested correlated significantly with GFR (P<0.001, P<0.0001, P<0.01 and P<0.0001). In the donor arteries an intact endothelium was observed forming a continuous monolayer with strong expression of VE-cadherin and ZO 1, which was not observed in the recipient arteries. In vitro, there was a significant increase in cell permeability, especially in cells treated with Pi and uremic pools (P<0.001). Through SEM, it was observed that among the three toxins tested, Pi is the one that induces greater loss of intercellular junction, similar to the effect of uremic serum in more severe stages of CKD. Genetic and protein expression of VE-cadherin decreased significantly (P<0.01), especially in cells treated with Pi3 and all uremic groups. On the other hand, in the analysis of ZO-1, it was observed that although the gene expression was significantly increased (P<0.01), the protein expression was decreased (P<0.05). In summary, uremia has been shown in vivo and in vitro to affect endothelial junctions, and the more advanced the CKD, the more endothelial involvement. The impact of uremia on the expression of VE-cadherin and ZO-1 is more significant in the moderate and severe stages of CKD and is distinct when analyzed separately for each toxin or uremic sera, suggesting different pathophysiological mechanisms. In vitro, it has been demonstrated that the gene and protein expression of VE-cadherin are decreased in more advanced stages of CKD. However, a greater gene expression of ZO-1 was observed, but a lower protein expression, which suggests a possible post-transcriptional regulation and a regulating role of this protein. Our study opens perspectives to evaluate the involvement of innumerable intercellular junction proteins in order to elucidate the relationship of uremia with endothelial dysfunction and vascular permeability