Variação somaclonal, metabolismo de carbono e caracterização bioquimica e imunologica nos cultivos celulares de Mandevilla velutina (Mart) Woodson (Apocynaceae)

Abstract

Resumo: Culturas de células de Mandevilla velutina em meios líquido e semi-sólido apresentaram taxas de crescimento segundo um modelo sigmoidal, com cinéticas distintas para a expressão do crescimento, como biomassa úmida e liofilizada, respectivamente. As curvas de dissimilação foram efetivas como método de análise de crescimento celular, dada a alta correlação apresentada com o peso fresco. Os clones auxotróficos quanto aos reguladores de crescimento ocorreram em maior número, porém alguns clones autótrofos foram identificados. Os fatores densidade de inóculo inicial e luz induziram a expressão da heterogeneidade genética presente nas populações. Os cultivos apresentaram ciclo mitótico assíncrono, variação morfológica elevada e agregados celulares freqüentes. Células com características embriogenéticas e cloroplastos funcionais foram observadas, indicando a expressão de funções especializadas associadas à diferenciação celular. Arabinose, fucose e ramnose não foram metabolizadas eficientemente pelos clones, enquanto glucose demonstrou uma pequena capacidade de sustentação do crescimento, sendo um fator limitante na concentração utilizada. Sintomas de toxicidez celular foram encontrados com a utilização combinada e isolada destes monossacarídeos. A biossíntese dos compostos velutinol A e MV 8612 (forma glicosilada) foi significativamente afetada pela variação nas fontes de carbono, com incrementos de 84% e 47%, respectivamente, com o uso de glucose a 3% em relação ao controle. Concentrações de MV 8612 similares ao controle foram encontradas com o uso de fucose a 3%, apesar do reduzido crescimento constatado. A utilização de hidrolases do caramujo Megalobulimus paranaguensis associada à Celluclast® viabilizou a protoplastização de 80% das células, com um período de incubação de 2 h, usando-se manitol a 0,5M como osmoticum. A composição estrutural das hemiceluloses de parede celular apresenta (3-D-glucose (20%), D-xilose (13 %) e L-ramnose (12%) como constituintes majoritários. Detectou-se ainda a presença de L-fucose (1 %), um deoxi-açúcar pouco comum em paredes celulares de vegetais superiores. Os resultados de 13C-RMN mostraram que a cadeia principal das hemiceluloses é uma P glucana, com peso molecular médio na faixa de 9900 e 13000 daltons. Células cultivadas in vitro foram imunógenos potentes por via Xintraperitoneal em camundongos. Verificou-se um aumento da especificidade de reconhecimento dos anticorpos com o avanço do processo de purificação dos anticorpos policlonais por cromatografia de troca iônica e imunoafinidade, o que indica a ocorrência de resposta restrita. A fração IgG purificada por imunoafínidade reconheceu possíveis determinantes antigênicos contendo Lfucose, os quais situam-se em áreas restritas da superfície celular. A existência de tipos celulares distintos nas populações cultivadas in vitro é inferida, devido aos gradientes de marcação de superfície celular observados por imunofluorescência indireta. As frações hemicelulósicas demonstraram distintos potenciais de antigenicidade, sendo a fração neutra da hemicelulose B (1M KOH) aquela mais intensamente reconhecida pelos anticorpos

Abstract: Mandevilla velutina cell suspension and calli cultures showed growth rate according to a sigmoid model and distinct kinetics for that parameter, as fresh and lyophilized biomass. Dissimilation curves were effective as analysis method conceming the cell growth, with a high correlation to the fresh weight. The most of the clones were auxotrofic as to growth regulators, however some autotrofíc ones were observed. The genetic heterogeneity presents in the cell population was expressed by manipulating initial inoculum density and light. An asynchronous mitotic cycle, frequent cell aggregates and several morphological types characterized the cell cultures, as well as embryogenetic cells and functional chloroplasts were found, showing the occurrence of cell differentiation. Arabinose, fucose and rhamnose were not metabolized for the clones, while glucose (3g%) was able in sustaining low growth rates, being a limiting factor. Cell cultures showed toxic symptoms as these monosaccharides were administered both in isolated or combined form. Velutinol A and MV 8612 (glicosylated form) biosynthesis was strongly affected by changing of the carbon sources, displaying increases of 84% and 47% when compared to the control, respectively, as cell cultures were fed with glucose 3g%. MV8612 concentrations similar to the control were found by using fucose 3g% as sole carbon source, in despite of the low cell growth observed. The hydrolase complex from the gastric juice of the snail Megalobulimus paranaguensis combined to Celluclast® yielded 80% of cell protoplastization, with an incubation time of 2 hours and mannitol 0.5M as osmoticum. The cell wall hemicellulose structural composition is based on P-Dglucose, L-rhamnose and D-xylose as major components, presenting also Lfucose, a less common deoxy-sugar in cell wall of higher plants. The hemicellulose backbone is a P-glucan, showing a molecular weigh range of 9,900-13,000 daltons. In vitro cultured cells were strong immunogens through intraperitoneal and subcutaneous via in mice and rabbits, respectively. Sequential ion-exchange and immunoaffínity chromatography allowed the obtainment of purified polyclonal antibodies with higher specificity along the purification steps, indicating the occurrence of restricted response in mice. The IgG fraction purified by immunoaffínity chromatography was able in recognizing antigenic xiideterminants containing L-fucose, which occur in restricted areas of the cell surface. The existence of distinct cell types is inferred due to the gradients of marking observed in the cell surface by indirect immunofluorescence reaction. Dot-blot assays revealed differences related to antigenic potential of the cell wall polysaccharides, with the neutral fraction of the hemicellulose B (KOH 1M) being stronger recognized