Clonagem, caracterização e sequenciamento dos genes nifA e nifB de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

A partir de um banco de genes de Herbaspirillum seropedicae construído no cosmídeo vetor pVK102 foi isolado o gene nifA daquele organismo por complementação do mutante FP10 nifA de Azospirillum brasilense. O plasmídeo recombinante pEMS1, contendo o gene nifA de H. seropedicae, foi identificado e caracterizado. Este plasmídeo não complementou os mutantes FP8 e FP9 (ntrC), FP3 (nifHDK) e FP6 (deficiente na produção de proteína MoFe). O fragmento Sal I de 2,0 kb do plasmídeo pEMS1 hibridizou fortemente com o gene nifA de Klebsiella pneumoniae, mas não com os genes nifHDK de A. brasilense. A região que continha o gene nifA de H. seropedicae foi mapeada numa extensão de aproximadamente 2,0 kb do plasmídeo pEMS1 por subclonagem e por hibridização. Nesta região e em suas adjacências foi demonstrado, após sequenciamento, a presença de uma ORF homóloga aos genes nifA de outros organismos e de uma ORF parcial correspondente ao gene nifB de H. seropedicae. A proteína NifA de H. seropedicae deduzida a partir da sequência de nucleotídeos possui alta homologia com outras proteínas NifA nos domínio D e E. Foi identificado ainda um interdomínio homólogo àquele presente nas proteínas NifA de Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium spp., Azorhizobium caulinodans. Sítios de ligação para NtrC e NifA e promotores -24/-12 foram identificados na região promotora do gene nifA de H. seropedicae. Após o gene nifA foi identificado também o gene nifB de H. seropedicae. A região N-terminal da proteína NifB de H. seropedicae possui alta homologia com as de B. japonicum e Azotobacter vinelandii. Dois sítios de ligação para NifA e um promotor -24/-12 foram identificados na região promotora do gene nifB de H. seropedicae. Com base nos dados da sequência de nucleotídeos dos gene nifA e nifB de H. seropedicae e nos resultados de fusões nifA::lacZ foi construído um modelo hipotético para a regulação da fixação de nitrogênio em H. seropedicae