Estudos sobre uma lectina isolada do fungo liquenzado Dictyonema glabratum (Sprengel) D. Hawksworth

Abstract

Resumo: A associação liquênica foi o primeiro sistema simbiótico reconhecido no qual não foram encontrados sinais de dano para qualquer um dos parceiros. Investigações das propriedades liquênicas têm contribuído sobremaneira para o melhor entendimento sobre os fungos macroscópicos, assim como sobre as associações simbióticas em geral. O fungo liquenizado Dictyonema glabratum (Sprengel) D.L. Hawksworth é um dos representantes dos basidiomicetos que se especializou na associação com cianofíceas do gênero Scytonema para a aquisição de compostos orgânicos obtidos a partir da produção fotossintética destas. Análises anteriores dos extratos deste líquen mostraram um alto teor protéico e a presença de proteínas com atividades hemaglutinantes, denominadas lectinas; moléculas que têm sido indicadas como determinantes de reconhecimento celular em diversos processos biológicos. O presente trabalho teve como propósito a obtenção da lectina majoritária do extrato aquoso de talos deste líquen, sua caracterização estrutural, caracterização de suas propriedades hemaglutinantes e investigação do seu envolvimento em alguma etapa do reconhecimento entre os simbiontes. São apresentadas as etapas de fracionamento e purificação desta molécula por dois procedimentos cromatográficos de troca iônica, que resultou numa fração com elevado grau de homogeneidade, conforme verificado por técnicas de SDS-PAGE, cromatografia de filtração em gel e espectrometria de massa. Estas análises também permitiram a identificação da massa molecular da amostra, correspondente a um dímero formado por duas subunidade de aproximadamente 16 KDa, com pi de 6,8, conforme experimento de isoeletrofocalização. A análise da composição dos aminoácidos das cadeias polipeptídicas mostrou alto teor de fenilalanina, Asx e Glx. Ensaios colorimétricos e cromatográficos (HPAEC) mostraram que estas cadeias apresentam baixo grau de glicosilação com predominância de galactose e xilose e ainda a presença de monossacarídeos aminados. Foi desenvolvida uma estratégia para o estudo dos oligossacarídeos ligados à porção protéica, mas este foi interrompido em virtude do baixo rendimento na obtenção destes compostos. Em relação às suas propriedades hemaglutinantes, a lectina de D. glabratum, mostrou maior afinidade por A-acetilgalactosamina, dentre os carboidratos testados em ensaios de inibição das reações de hemaglutinação, que também indicaram maior ligação com eritrócitos humanos do tipo A. Esta molécula requer a presença de cátions bivalentes para sua atividade, que mantém seus melhores índices numa faixa de pH entre 5,0 e 7,0 e ainda se mostrou termoestável em temperatura de até 35 °C. Ensaios de imunocitoquímica em que foram utilizados anticorpos policlonais anti-LDG permitiram localizar a lectina na superfície das hifas do micobionte e em especial nas regiões próximas ao contato com as cianofícias no talo. O fotobionte associado foi isolado, cultivado e utilizado em estudos de interação com a lectina e os resultados foram comparados com ensaios utilizando-se o fotobionte isolado do talo, imediatamente antes da realização do experimento. Verificou-se a interação da lectina com o fotobionte recém removidos do talo, mas o mesmo não foi observado para aquele cultivado. Desta forma, a lectina estudada parece estar envolvida em algum processo de reconhecimento contínuo entre os simbiontes após o estabelecimento do talo liquênico, mas não na etapa de reconhecimento inicial entre os componentes isolados, uma vez que esta não foi reconhecida pelas células fotossintetizantes na ausência do micobionte

Abstract: The association in lichens was the first symbiotic system ever recognized in which no obvious signs of harm or damage to either biont was evident. Investigations on lichen properties have greatly contributed to the knowledge of general mycology and symbiosis. The lichenized fungus Dictyonema glabratum (Sprengel) D.L. Hawksworth is one of the few representative of basidiomycetes, specialized in its association to a cyanobacterium from the Scytonema genus, for the acquisition of organic compounds from photosynthesis. Previous analysis on lichen thalus extracts showed that it contains a high levei of protein and the occurrence of hemagglutinating active proteins, lectins - molecules that have been considered as determinants in processes of cellular recognition. The present thesis has the aim of obtaining the major lectin from aqueous extracts, to characterize its molecular stracture, its hemagglutinating properties and to investigate its participation on any step of symbiont recognition. Two chromatographic procedures were used for the acquisition of a fraction with a high degree of homogeneity, as determined by ESI-MS, gel fíltration and SDS-PAGE examination. Its molecular mass was investigated, which indicated its native conformation as a dimer formed by two identical subunits of 16.540 Da. It has a pi of 6.8. Amino acid analyses showed the predominance of Phe, Asx and Glx in its primary structure. Colorimetric assays and High Performance Anionic Exchange Chromatography (HPAEC) showed a low degree of glycosylation (~1%), containing galactose and xylose as predominant neutral monosaccharides, in addition to ÍV-acetylglucosamine and TV-acetylgalactosamine. A methodology for the investigation of glycosylation pattems of the oligosaccharides was established, but it was not taken ahead because of the low quantities of these compounds. Agglutination of human erythrocytes by the lectin required divalent cations, being more stable at 35° C for at least 1 h and between pH 5.0 and 7.0. Among the various compounds tested for hemagglutination inhibition, A-acetylgalactosamine was the most active. Immunocytochemical assays, using anti-LDG (D. glabratum lectin) antibodies permitted the localization of the lectin at the fungai surface, especially at the algal layer inside the thallus. Photobiont cells were isolated, cultivated, and used in experiments of interaction with the lectin. The results were compared with those in which the photobionts were isolated immediately before the assay. It was shown that the lectin was able to interact to newly isolated cells but failed to associate to the cultivated ones. These results may indicate the involvement of the lectin in processes of continuous recognition between symbionts after the establishment of the lichen thallus, but not at initial recognition steps, considering that the lectin could not be recognized in the absence of mycobiont