Regulação da transcrição do gene nifA de Herbaspirillum seropedicae pelas proteínas NTRC, NIFA e IHF

Abstract

Resumo: Os promotores dependentes do fator crN requerem a ligação de uma proteína ativadora a um sítio de ligação localizado a montante do promotor. O gene nifA de Herbaspirittum seropedicae possui na sua região promotora, além de uma seqüência promotora do tipo -24/-12, dois sítios de ligação para NtrC, três sítios para NifA e um para IHF. A presença destes elementos sugere que este promotor é regulado por amônio através das proteínas NtrC e NifA, e requer a presença de ctn além da possível participação de IHF na sua regulação. Para determinar a contribuição de NtrC, NifA, IHF e cN para a transcrição do gene nifA, foram realizados experimentos de transcrição in vivo e in vitro. Nos experimentos in vivo, a região promotora foi mutagenisada e os promotores obtidos clonados num vetor de fusão com o gene lacZ foram analisados em diferentes condições para avaliar o modo de regulação deste promotor. Para os experimentos in vitro, as proteínas reguladoras foram purificadas e os ensaios conduzidos utilizando-as junto com o promotor clonado num vetor de transcrição, onde a contribuição de cada proteína pôde ser analisada isoladamente. Os resultados mostraram que na estirpe selvagem SMR1, o promotor nativo teve uma atividade 5-8 vezes maior na ausência que na presença de íons amônio, enquanto um alto nível de oxigênio (ar) causou apenas uma diminuição de 20-30% na atividade do promotor. Análises in vivo dos promotores mutagenisados também mostraram que a ativação deste promotor é primariamente dependente da proteína NtrC em condições de baixos níveis de amônio, e que NifA contribui para a transcrição de nifA quando os níveis de oxigênio são diminuídos. A mutagênese no promotor -24/-12 aboliu completamente a atividade do promotor, confirmando que este promotor é ativo. Deleção do sítio para ligação de IHF produziu um promotor com atividade 2 vezes maior que o nativo na estirpe selvagem, mas não na estirpe nifA', indicando que IHF controla a auto ativação do promotor nifA pela proteína NifA. Os experimentos de transcrição in vitro mostraram que IHF estimula a transcrição dependente de NtrC, mas inibe a dependente de NifA. Além disso, altos níveis de NifA limitam a ativação por NtrC, mas somente na presença de IHF. Quando analisados conjuntamente os resultados sugerem que a transcrição do gene nifA é dependente do fator ctn e que as proteínas NtrC e NifA podem ativar sua transcrição. Além disso, IHF age positivamente estimulando a ativação por NtrC e negativamente impedindo que NifA ative sua própria transcrição e, portanto, a expressão excessiva de NifA que poderia ter um efeito danoso para as células. Uma vez que os experimentos defootprinting mostraram que as proteínas reguladoras ligam-se a seus sítios, isto sugere que estes efeitos são devido às proteínas ligadas à região promotora do gene nifA de H. seropedicae

Abstract: Control of transcription in prokaryotes often involves direct contact of regulatory proteins with RNA polymerase. For the <rN RNA polymerase, regulatory proteins bound to distally located enhancers engage the polymerase via DNA looping, which can be facilitated by the IHF (Integration Host Factor) protein. The presence of two putative NtrC-binding sites, three NifAbinding sites, an IHF-binding site and a -24/-12 type promoter suggested that NH4+ leveis regulate nifA expression in Herbaspirillum seropedicae in a NtrC-/Ni£A-dependent way and require the altemative aN factor. It also suggests IHF plays a regulatory íunction on this promoter. To determine the contributions of NtrC, NifA and IHF to transcription from the nifA promoter of H. seropedicae we conducted in vivo and in vitro transcription assays. In the in vivo experiments, mutations and deletions were introduced in the nifA promoter and the resulting promoters fosed to a promoterless lacZ gene and this fusions were tested under different conditions. The in vitro assays were conducted with the purified proteins and the nifA promoter cloned into a transcription vector. Results showed that in the wild type H. seropedicae strain SMR1 the native nifA promoter had an activity 5-8 fold higher in the absence than in the presence of ammonium ions, whereas oxygen (air) caused only a 20-30% drop in nifA expression. In vivo analysis in E. coli and H. seropedicae of the nifA promoter containing deleted or mutated sites showed that nifA expression is primarily dependent on NtrC under nitrogenlimiting conditions but also required NifA for maximal expression under nitrogen-fixing conditions. Both NtrC and NifA activated expression from the -24/-12 promoter since mutation of the conserved guanines at -24 and -13 positions to thymines abolished promoter activity in both E. coli and H. seropedicae backgrounds. Deletion of the IHF-binding site upstream from the NifA-binding site 2 produced a promoter with activity 2-fold higher than that of the native promoter in the H. seropedicae wild type strain but not in the nifA' strain, indicating that IHF Controls NifA auto-activation. Experiments in an E. coli ih f strain also showed that the IHFbinding site is functional and Controls NifA activation of the nifA promoter. IHF is apparently required to prevent overexpression of the NifA protein via auto-activation under nitrogen-fixing conditions in H. seropedicae. DNasel footprinting experiments showed that the identified regulatory sites functioned for protein binding. Their involvement in the promoter regulation was explored. In vitro, activation of the nifA promoter by NtrC is stimulated by the DNA bending protein IHF. In marked contrast activation by NifA is greatly reduced by IHF, thus diminishing potentially destábilising auto-activation of the nifA promoter by NifA. Additionally, high leveis of NifA appear to limit NtrC-dependent activation. This inhibition is IHF-dependent. Therefore IHF acts positively and negatively at the nifA promoter to restrict transcription activation to NtrC and one signal transduction pathway