Clonagem, isolamento e caracterização do gene recA de Herbaspirillum seropedicae estirpe z78

Abstract

Resumo: A partir de um banco genômico de Herbaspirillum seropedicae estirpe Z78, construído no cosmídeo vetor pLAFR3, foi isolado um gene análogo ao recA por complementação interespecífica da estirpe mutante Escherichia coli HB101 (recA). Seis plasmídeos recombinantes "pLAFR3::DNA de H. seropedicae Z78" foram isolados e passaram a constituir a série pBMR1 a pBMR6. O plasmídeo pBMR5 foi escolhido para estudos mais detalhados. Resultados quantitativos de sobrevivência mostraram que este plasmídeo foi capaz de conferir resistência à radiação ultravioleta e ao metanosulfonato de metila (MMS) à estirpe E. coli HB101. Além disto, o plasmídeo pBMR5 restaurou a proficiência de recombinação homóloga após conjugação de E. coli HB101. Estudos de hibridização DNA/DNA revelaram a existência de homologia estrutural entre o gene recA de E. coli K12 e o gene recA de H. seropedicae Z78 contido no plasmídeo pBMR5. O DNA inserto deste plasmídeo apresentou sítios de restrição para as enzimas BamHI, BglII, EcoRI e HindIII. O fragmento HindIII de 3,65 kb que continha o gene recA de H. seropedicae Z78 foi subclonado no vetor pTZ18R dando origem ao plasmídeo pBMR503. Este plasmídeo conferiu à E. coli HB101 níveis de complementação fisiológica iguais àqueles obtidos para pBMR5. Um derivado recA? do plasmídeo pBMR5 foi obtido por inserção do transposon Tn5. Este plasmídeo, denominado pBMR26.2, foi incapaz de restaurar a proficiência de recombinação ou de conferir resistência à radiação ultravioleta ou ao MMS às estirpes HB101 e DH5 de E. coli. Os dados obtidos neste trabalho sugerem fortemente a existência de um gene tipo recA em H. seropedicae Z78, bem como a funcionalidade de um sistema de reparo e recombinação análogo ao Sistema SOS de E. coli.