Seleção de microorganismos e caracterização de sua enzima ciclodextrina glicosiltransferase

Abstract

Resumo: Este trabalho foi realizado com os objetivos de desenvolver uma metodologia de seleção rápida e prática de novos microrganismos produtores de ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), bem como estudar esta enzima quanto as sua condições de produção, purificação, caracterização, cinética enzimática, e a partir de vários substratos, verificar as condições para a produção de beta e gama ciclodextrina (0 e y-CD), com ênfase no aumento da seletividade de produção de y-CD. A primeira etapa de seleção de microrganismos produtores de CGTase foi realizada em placa com meio alcalino de pH 10,3 contendo os corantes vermelho do congo e xileno cianol FF que indicam a produção de y-CD pela formação de halo incolor ao redor das colônias positivas. A segunda etapa de seleção foi aplicada às cepas positivas da primeira etapa, trocando-se os corantes por fenolftaleína e alaranjado de metila que indicam a presença de 0- e a-CD, respectivamente. As cepas com menor halo na segunda etapa foram escolhidas, o que permitiu isolar cepas produtoras de CGTase, com maior seletividade para y-CD. Foram isoladas 57 cepas, sendo a CGTase da cepa 37 que apresentou a maior atividade no teste de precipitação de CD com tricloroetileno. O estudo taxonômico da cepa 37 identificou-a como sendo Bacillus fírmus. O peso molecular da CGTase da cepa 37 foi determinado por eletroforese resultando em 77 580 daltons. A maior produção de CGTase da cepa 37 foi obtida em meio de cultura alcalino contendo polipeptona e extrato de levedura. A CGTase da cepa 37 foi purificada através de precipitação com sulfato de amônio 80% de saturação, seguida de cromatografia de afinidade bioespecífica e ultrafiltração em microconcentradores. Foi obtido uma purificação de 157 vezes e um rendimento de atividade de 65,3%. A produção de CDs com maltodextrina 10% (p/v) e 1 mg de CGTase da cepa 37/L durante 22 horas, a 50°C, pH 8,0, foi igual a 16 mM de 0-CD, 2,5 mM de y-CD e 0,085 mM.de a-CD, alcançando uma conversão do substrato de 21,4%. A razão de y- para 0-CD, de 0,156, confirma que esta enzima é uma 0-CGTase. A 50°C as máximas atividades específicas da CGTase da cepa 37 foram 104,1 U/mg no pH 6,0 para a 0-CD, e 5,0 U/mg no pH 8,0 para a y-CD. Fixando-se o pH em 8,0, asxxix temperaturas de máxima atividade específica foram 65°C para a p-CD com 71,5 U/mg, e 70°C para a y-CD com 9,1 U/mg, respectivamente. Portanto, tanto para o pH quanto para a temperatura ótima da enzima, os valores de atividade específica máxima foram diferentes para os produtos p-CD e y-CD, fato este bastante vantajoso, pois permite direcionar a produção para um dos produtos. Embora a enzima tenha uma maior atividade a 65°C quando da determinação da p-CD produzida, ela é mais estável, na presença de CaCI2, a 60°C. A energia de ativação da reação de produção de CDs com maltodextrina 10% (p/v), pH 8,0, e com a enzima CGTase da cepa 37 é de 7,51 kcal/mol para a produção de p-CD e 9,46 Kcal/mol para a produção de y-CD. O tempo de meia vida de atividade para esta enzima incubada na mesma solução de maltodextrina é superior a 11 horas para temperaturas inferiores a 60°C. A energia de inativação térmica desta enzima na presença de 5 mM de CaCh na solução de maltodextrina foi igual a 38,988 kcal/mol. A enzima segue a cinética de MichaelisMenten apenas à baixa concentrações do substrato, apresentando diferentes valores de Km e Vmáx para a produção de p- e y-CD, respectivamente, Km = 3,3 mmol de maltodextrina/L, Vmáx = 887,8 mmol de p-CD/L.h no caso da p-CD e Km = 15,1 mmol de maltodextrina/L, Vmáx = 79,1 mmol de y-CD/L.h no caso da y-CD. Para concentrações de substrato acima de 7,5 mM no caso da p-CD, e 22,4 mM no caso da y-CD, já se nota sensível inibição da enzima pela maltodextrina, com constantes cinéticas de inibição pelo substrato, 92,8 e 98,5 mmol de maltodextrina/L respectivamente nos casos de p- e y-CD. Portanto, o aumento na concentração de substrato inibe a CGTase da cepa 37, e tem maior influência na atividade da enzima com relação a produção de p-CD do que yCD. O uso de 2,5% (p/v) de glicirrizina no meio reacional contendo amido de milho 10% (p/v), favoreceu uma produção, após 24 horas de ensaio, de 59% de y-CD e 40% de pCD, contra 15% de y-CD e 85% de p-CD quando do uso de meio reacional contendo somente maltodextrina 10% (p/v). Portanto, a CGTase da cepa 37 de Bacillus firmus é uma p-CGTase, capaz de produzir mais y-CD do que p-CD quando do uso de glicirrizina como agente complexante, sendo o melhor substrato para esta produção, o amido de milho

Abstract: This work had as objectives the development of a rapid and practical selection method for screening microorganisms that produce cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase); the study of their enzyme, regarding its conditions of production, purification, characterization, and enzymatic kinetics; and starting from various substrates, the study of the conditions for the production of beta- and gammacyclodextrins (0- and y-CD), with emphasis on increasing the selectivity for the production of y-CD. The first step for screening the microorganisms that produce CGTase used an alkaline plate medium, pH 10.3, containing the dyes, congo red and xylene cyanole FF that indicate the production of y-CD through the formation of a clear halo around the positive colonies. A second screening step was applied to the isolated positive microorganisms, changing the dyes to phenolphthalein and methyl orange that indicate the presence of 0- and a-CD, respectively. The colonies with smaller halos in the second screening step were chosen because they produced a CGTase with higher selectivity for y-CD. A total of 57 strains were selected, being the CGTase from strain no. 37 that has shown the greatest enzyme activity in the test that quantify the CD produced by precipitation with trichloroethylene. The taxonomic study of strain no. 37 has identified it as Bacillus firmus. The molecular weight of the enzyme was determined by SDS-PAGE giving 77,580 daltons. The greatest production of CGTase from strain no. 37 was obtained with an alkaline cultivation medium containing polipeptone and yeast extract. The CGTase from strain no. 37 has been purified by precipitation with ammonium sulfate (80% saturation), followed by biospecific affinity chromatography and ultrafiltration in microconcentrators. The purification factor obtained was 157, and the yield in a activity was 65.3%. The production of CDs with 10% w/v maltodextrin and 1mg/L of the CGTase from strain no. 37, after a period of 22 hours at 50°C, pH 8.0, was 16 mM of 0-CD, 2.5 mM of y-CD, and 0.085 mM of a-CD, and the substrate conversion reached 21.4%. The ratio of y-CD to 0-CD, 0.156, confirms that this enzyme is a 0- CGTase. At 50°C the maximum specific activities of the CGTase from strain no. 37 were, 104.1 U/mg at pH 6.0 for 0-CD, and 5.0 U/mg at pH 8.0 for y-CD. Fixing the pH atxxxi 8.0, the temperature for maximum specific activities were 65°C for p-CD giving 71.5 U/mg, and 70°C for y-CD giving 9.1 U/mg, respectively. Therefore, both optimum values for pH and temperature, for the production of p- and y-CD were different. This is advantageous since greater production of one of the products can be achieved by appropriate choice of the operating conditions. Although the enzyme is more active at 65°C for the production of P-CD, it is more stable, in the presence of CaCI2, at 60°C. For the reaction that produces CDs from maltodextrin 10% w/v, at pH 8.0, and the CGTase from strain no. 37, the energy of activation is 7.51 and 9.46 kcal/mol for the production of p- and y-CD, respectively. This enzyme when incubated in the same substrate solution has a half-life greater than 11 hours for temperatures below 60°C. The energy of thermal inactivation of this enzyme, in the presence of 5 mM CaCI2, is 39.988 kcal/mol. The enzyme follows Michaelis-Menten kinetics only at low substrate concentration, showing different Km and Vmax values for production of p- and y-CD, namely, Km = 3.3 mmol of maltodextrin/L, Vmax = 887.8 mmol of p-CD/L.h in the case of P-CD, and Km = 15.1 mmol maltodextrin/L, Vmax = 79.1 mmol of y-CD/L.h, in the case of y-CD. For substrate concentration above 7.5 mM in the case of P-CD, and 22.4 mM in the case of y-CD, enzyme inhibition by the maltodextrins are clearly seen, giving substrate inhibition constants equal to 92.8 and 98.5 mmol of maltodextrin /L, for p- and y-CD production, respectively. Therefore, high substrate concentration inhibits the CGTase from strain no. 37, and this effect is greater in the case of p-CD production. The use of 2.5% w/v of glycyrrhizin in a reaction medium containing 10% w/v com starch, has led to a production of 59% y-CD, 40% p-CD after a period of 24 hours, whereas when maltodextrin alone was used the yields were 15% of y-CD and 85% of pCD. Therefore, the CGTase of the strain no. 37 of Bacillus firmus is a p-CGTase that can produce more y-CD than P-CD when glycyrrhizin is used for y-CD complexation, and corn starch is the best substrate in that case