Atividade biológica in vitro de heteropolissacarídeos sulfatados e/ou carboxilados, isolados de macroalgas marinhas, sobre células HeLa

Abstract

Resumo: As fucanas de Sargassum stenophyllum foram obtidas por extração aquosa à temperatura ambiente, e purificadas por precipitação com cetavlon e posterior descomplexação com 4 mol L'1 de NaCI. Esta fração (FP, relação sulfato/açúcar total de 0,3), foi submetida à hidrólise ácida parcial (0,05 mol L'1 H2S 04, 100°C, 45 min.) e os produtos fracionados por cromatografia de troca iônica. As frações eluidas com 0,5 mol L'1 (FD2) e 1,0 mol L"1 NaCI (FD3), apresentaram rendimentos de 63 e 12,6%, respectivamente. A fração FD2, relação sulfato/açúcar total de 0,18, é constituída por fucose (15,5 mol%), galactose (40,4 mol%), manose (19 mol%), xilose (13,2% mol%), glucose (11,9 mol%). A presença de ácido glucurônico (11,7%) foi confirmada após carboxiredução de FD2 e utilizando derivado de carbodiimida. FD2 foi modificado por sulfatação química (FD2-s), apresentando relação molar sulfato/açúcar total de 0,51, carboxi-redução (FD2-c), e também pelos dois procedimentos, resultando a fração FD2-cs. Os resultados de análises de metilação, FTIR e RMN-13C indicam que FD2 apresenta uma cadeia principal constituída por manose 2-O-substituída (98,3 ppm) ramificada em C-3 e C- 4. Galactose está principalmente 4-O-substituída (77,2 ppm) e 3-O-substituída (80,9 - 80,1 ppm) ramificada em C-6. As unidades de galactose correspondem, no polímero nativo (F3B) a pontos de ramificação por unidades de fucose, as quais no polímero parcialmente defucosilado (FD2) estão principalmente 3-Osubstituídas (sulfatadas em C-4) e 2-0- e 4- O-substituídas. Glucose e ácido glucurônico são principalmente 4-O-substituídos e ramificados em C-3, tanto em F3B como em FD2. A avaliação da citotoxicidade, alteração da capacidade mitótica, além da interação com moléculas de matriz extracelular das células HeLa, foi realizada com fucanas nativas de S. stenophyllum, e também com polissacarídeos lineares, previamente isolados e caracterizados, como galactanas sulfatadas (de Bostrychia montagnei e Porphyra columbina) e alginatos (de Laminaria brasiliensis e S. stenophyllum). Desses polímeros, apenas as fucanas ocasionaram alteração da morfologia e diminuição significativa da monocamada de células HeLa. Fucanas nativas (F-3B, F-5B) e modificadas por hidrólise parcial, seguida de sulfatação química (FD2-s) alteraram significativamente a morfologia, proliferação destas células. Entretanto as frações com menor densidade de carga, FD2 e FD2-C alteraram pouco ou não causaram modificações nestes parâmetros. A interferência desses polímeros na adesão de células HeLa sobre substratos de moléculas de matriz extracelular específicas foi verificada. Na presença de laminina-1, e das frações F-5B, FD2-s e F-3B ocasionaram inibição de 92%, 86,4% e 80%, respectivamente. As frações FD2-cs e FD2 causaram menor grau de inibição (65% e 60,5%, respectivamente). Com a matriz de fibronectina, somente as frações F-3B e F-5B (80 p,g mL'1) promoveram inibição de 25 e 15%, respectivamente. Com a matriz de vitronectina ocorreu inibição de 30% com as frações F-3B e F-5B (80 jig mL'1) e também com a fração FD2 (28%), FD2-S (34,5%) e FD2-cs (30%), respectivamente. Ressalta-se que a fração FD2-C (fração menos carregada negativamente) promoveu diminuição da adesão de células HeLa à laminina-1 em 25%, porém aumentou a adesão celular com matriz de fibronectina em 60%, na concentração de 160 p,g mL'1. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que a presença de cadeias laterais, ácidos urônicos, mas principalmente o alto grau de cargas negativas do polímero (grupos sulfato e carboxílicos), bem como a distribuição de cargas da molécula são essenciais para que ocorra citotoxicidade, alterações na divisão celular, alterações morfológicas e interferência na adesão das células HeLa

Abstract: A fucan sulfate obtained from the brown seaweed Sargassum stenophyllum, by aqueous extraction at room temperature, was submitted by Cetavlon 10% precipitation, followed by decomplexation with 4 mol L'1 NaCI. This fraction (FP, total carbohydrate/sulfate 0.3) was submitted to partial acid hydrolysis (0,05 mol L'1 H2S04, 100°C, 45 min.) and the products fractionated by anion exchange chromatography. Stepwise elution with 0.5 mol L'1 (FD2) and 1.0 mol L'1 NaCI (FD3), shown 63% and 12,6% yield, respectively. The FD2 fraction, shown total carbohydrate/sulfate 0.18, contained by Fuc (15.5 mol%), Gal (40.5 mol%), Man (19.0 mol%), Xyl (13.2 mol%), Glc (11.9 mol%) and GlcA (11.7%). FD2 was submitted to several Chemical treatment, how sulfation, resulting in fraction FD2-S, which had ratio of total carbohydrate/sulfate of 0.51, and on carboxy-reduction (NaBH4), gave fraction FD2-C, or both treatments, gave fraction FD2-cs. The results of methylation, FTIR and RMN-13C analysis of FD2 fraction, suggest the backbone is formed by mannose 2-O-substituted (98.3 ppm) with ramification in C-3 and C- 4. Galactose is mainly 4-O-substituted (77.2 ppm) and 3-O-substituted (80.9 - 80.1 ppm) with ramification in C-6. Glucose and glucuronic acid are mainly 4-O-substituted with ramification in C-3 (F3B and FD2). The cytotoxic effect, mitotic alterations, and extracellular matrix interactions were performed on HeLa cell cultures, with linear polysaccharides, previously characterized, such as sulfated galactans (from Bostrychia montagnei and Porphyra columbina) and alginates (from Laminaria brasiliensis and S. stenophyllum) and native fucans from Sargassum stenophyllum. Only fucans modified FleLa cell morphology, and lowered significantly the cell number. Considering these results, native fucans (F-3B and F- 5B) and derived polysaccharides (FD2, FD2-S, FD2-C and FD2-cs) from S. stenophyllum were chosen for specific evaluations. Fractions F-3B, F-5B and FD2-S gave rise to significant modifications of morphology, cellular proliferation, among other effects. Fractions showing low charge density, FD2 and FD2-C did not modified these parameters. Effects on adhesion properties were evaluated using the polysaccharides under study and specific extracellular matrix components such as. Fractions F3-B, F5-B, FD2-S, FD2-cs and FD2, at 160 pg mL'1 were able to inhibit 80%, 92%, 86%, 65% and 60.5%, respectively, the interaction of the cells with laminin-1. With fibronectin matrix, only fractions F-3B and F-5B (80 jLtg mL'1) promoted inhibition of 25 and 15%, respectively. With the vitronectin matrix, 30% inhibition occurred with fractions F-3B and F-5B, at 80 pg mL'1, and low significant inhibition with FD2 (28%), FD2-S (34.5%) and FD2-cs (30%) at the same concentration. Fraction FD2-C decrease cellular adhesion with laminin-1 at 25% but increased (60%) with fibronectin matrix, at the 160 pg mL'1. The results obtained showed that the presence of branches, degree of negative charges (sulfate and/or carboxylic groups), and charge distribution in the molecule are essential for cytotoxicity, mitotic and morphological alterations, and interference of HeLa cell adhesion