Analise funcional e estrutural da proteina PII, controladora da fixação de nitrogenio em herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: Dois cosmídeos capazes de completar o fenótipo Ntr' do mutante glnB de Klebsiella pneumoniae foram isolados de uma biblioteca genômica de Herbaspirillum seropedicae. Estes cosmídeos foram denominados pEMBlOO e pEMBlOl e ambos hibridizaram com uma sonda de DNA contendo o gene glnB de K. pneumoniae. Uma região do cosmídeo pEMBlOl homóloga ao gene glnB de K. pneumoniae foi completamente sequenciada. A análise desta região mostrou a presença de uma orf completa com 339 pb e o produto de tradução produzido tem uma alta homologia com a proteína PII (produto do gene glnB) de vários organismos. A montante do gene glnB de H. seropedicae foi identificada uma seqüência promotora do tipo a 70 e uma região codificadora para proteína, que apresentou homologia com a NAD-sintetase amônia dependente. Um fragmento de 0,6 Kb Sali-Pstl contendo a região promotora do gene glnB foi clonado no vetor de expressão pPW452 e a análise da atividade de P-galactosidase mostrou que este promotor é expresso constitutivamente em H. seropedicae. O gene glnB de H. seropedicae foi mutagenizado por inativação insercional com o transposon Tn5-20. O mutante cromossomal obtido (estirpe BI2-27) foi capaz de crescer em meio contendo 10 mmol/L de nitrato de potássio como única fonte de nitrogênio, mas foi incapaz de fixar nitrogênio. Como na estirpe selvagem (SMR1), a expressão do gene nifA na estirpe mutante foi dependente dos níveis de amônia no meio, mas, ao contrário da estirpe selvagem, não houve expressão do gene nifB em nenhuma condição testada, sugerindo que a proteína PII (produto do gene glnB) participa do controle da atividade da proteína NifA em H. seropedicae. Para entender o papel da proteína PII em H. seropedicae, o gene glnB de H. seropedicae foi clonado em um vetor de expressão e a proteína PII foi superexpressa e purificada na forma fundida a seis resíduos de histidina (PII-His) ou na forma nativa (PII) em E. coli (RB9065UDE3, glnD', glnB ). As proteínas PII e PII-His foram purificadas e estudos cinéticos mostraram que as duas proteínas são uridililadas tanto pelo extrato livre de células de H. seropedicae como pela proteína GlnD de E. coli. A uridililação da proteína PII de H. seropedicae foi dependente de 2-oxoglutarato, estimulada por ATP e inibida por glutamina. Tanto extratos livres de células preparados com células cultivadas em condições de limitação como em excesso de íons amônio apresentaram atividade de uridililtransferase sugerindo que em H. seropedicae existe um gene homólogo a glnD e que a sua expressão é independente dos níveis de amônia. A proteína PII foi cristalizada e a sua estrutura determinada por substituição molecular em dois grupos espaciais diferentes. A proteína PII de H. seropedicae é um homotrímero e o monômero apresenta um duplo motivo PaP, a volta B que contém um sítio de ligação para ATP e a volta T que contém o resíduo de Tyr51. Esta última volta não foi visualizada na estrutura do cristal da proteína de H. seropedicae. A região C-terminal da proteína PII de H. seropedicae foi a que apresentou a maior diferença estrutural com a de E. coli. O resíduo de Glyl08 na PII de H. seropedicae provoca uma curvatura da cadeia principal que não é observada na estrutura da proteína PII de E. coli, sugerindo que esta região pode estar envolvida em interações diferentes daquelas da proteína PII de E. coli

Abstract: Two cosmids isolated from a Herbaspirillum seropedicae genomic library complemented the Ntr " phenotype of a Klebsiella pneumoniae glnB mutant. These cosmids, pEMBlOO and pEMBlOl, hybridized to a DNA probe containing the glnB gene from K. pneumoniae. The region of the cosmid pEMBlOl homologous to the glnB gene of K. pneumoniae was sequenced. The analysis of this sequence showed a complete orf of 339 bp and the translation product had a high homology with the PII proteins (products of glnB genes) of several organisms. Upstream of the glnB gene of H. seropedicae was identified a sequence resembling a cr70 promotor and also an open reading frame homologous to ammonium-dependent NAD-synthetase. The SaB-Pstl fragment of 0,6 Kb containing the putative promotor region of the glnB gene was cloned into the lacZ fusion vector pPW452 and the (3-galactosidase activity showed that this promotor was constitutively expressed in H. seropedicae.The glnB of H. seropedicae was mutagenized by insertional inactivation with the transposon Tn5-20 The glnB::Tn5-20 mutant of H. seropedicae (strain BI2-27) was able to grow utilizing potassium nitrate (10 mmol/L) as the sole nitrogen source, but was unable to fix nitrogen. Although the nifA expression in the mutant was dependent on the ammonium leveis in the medium as in the wild type (SMR1), the nifB gene was not expressed and the Nif ~ phenotype suggests that the PII protein (product of the glnB gene) is involved in the control of NifA. activity in H. seropedicae. To understand the role of PII in H. seropedicae, the glnB gene of H. seropedicae was cloned in an overexpression vector (pET28b+) and the PII protein was overexpressed in E. coli RB9065À.DE3 (glnD", glnR). This protein was purified either fused to a hexa-histidine tag (PII-His) or in the native form (PII). Both purified proteins were uridylylated either by cell free extracts of H. seropedicae or the purified GlnD protein from E. coli. The uridylylation of PII protein from H. seropedicae was dependent on 2- oxoglutarate, stimulated by ATP and inhibited by glutamine. Free cell extracts prepared from cells grow under nitrogen limitation as well as under excess of ammonium ions had uridylyltransferase activity, suggesting that in H. seropedicae there is a homologous gene to glnD and that its expression is independent of the ammonium leveis. The PII protein was crystallized and it structure was determined by molecular replacement in two different space groups. The PII protein of H. seropedicae is a homotrimer and the monomer presents a double Pa|3 motif, a loop B that contains a consensus sequence for ATP binding and the T loop which contains Tyr51 although latter loop was not observed in the crystal structure of H. seropedicae. The C-terminal region of H. seropedicae PII differed from that of the E. coli protein. The residue Glyl08 induced a bend in the main chain that was not observed in the E. coli PII structure, suggesting that this region may be involved in different interactions from those observed for the E. coli PII