Edição genômica de tripanina e kharon em Trypanosoma cruzi provoca alterações fenotípicas sem comprometer a passsagem pelo ciclo de vida in vitro

Abstract

Resumo: Trypanosoma cruzi, o agente causal da doença de Chagas, possui um flagelo único ligado ao corpo através da zona de adesão do flagelo e o corpo basal. Esta estrutura celular tem sido mostrada como crucial para a motilidade, divisão celular e sobrevivência de Tripanosomatídeos. Da mesma forma, proteínas associadas ao citoesqueleto são importantes para manutenção da morfologia, logo podendo comprometer o desenvolvimento do parasito. A caracterização de prováveis proteínas de citoesqueleto/flagelares de T. cruzi é de grande importância, pois permite identificar o papel dessas proteínas na biologia do parasito, além de determinar os componentes flagelares com funções comuns e divergentes entre os Tripanosomatídeos. Em Trypanosoma brucei já foi demonstrado que o flagelo participa de importantes processos biológicos como duplicação e diferenciação do parasito, além de, aparentemente, ser importante para a infecção do hospedeiro. No entanto, em T. cruzi existem poucas proteínas de flagelo caracterizadas funcionalmente. O flagelo, apesar de possuir uma estrutura microscópica conservada, pode apresentar diferenças significativas em função dos genes ortólogos os quais podem possuir funções específicas para a espécie ou formas do parasito. Esforços para caracterizar funcionalmente algumas proteínas de T. cruzi, incluindo as de flagelos, têm sido feitos como a utilização de tecnologias de superexpressão de genes, Knock-out clássico e análises de transcriptomas. A falta da completa caracterização de genes é devida, em parte, à existência de poucas ferramentas para a manipulação genética de T. cruzi. Os avanços no sistema de edição gênica baseado no sistema CRISPR/Cas9 nos permitiu a caracterização das alterações fenotípicas pela ablação da expressão de 2 proteínas associadas com o citoesqueleto. Os mutantes TcTripanina -/- apresentam alterações significativas, tais como, redução na taxa de crescimento, diferenciação em tripomastigotas metacíclicos (MTs) e infecção em monocamadas de células in vitro, além de uma drástica queda na motilidade e alterações na morfologia. Esta é a primeira proteína associada ao axonema e citoesqueleto caracterizada em T. cruzi. Já os mutantes TcKharon -/- mostraram pronunciada alteração morfológica em formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas, essa alteração na morfologia causa uma diminuição do crescimento e, aparentemente, não afeta a diferenciação. A proteína TcKharon::GFP assim como TcTripanina::GFP foram detectadas na fração de citoesqueleto quando superexpressas em parasitos selvagens, e sua expressão nos parasitos mutantes foram capazes de reverter as alterações fenotípicas causadas pela edição. Diferente de T. brucei ou Leishmania mexicana, deficientes na expressão de Tripanina ou Kharon, ambos mutantes de T. cruzi foram capazes de completar o ciclo de vida, ou seja, mesmo os estágios presentes no hospedeiro mamífero mantiveram a viabilidade. Estes dados destacam a necessidade de identificar o core de proteínas de citoesqueleto/flagelo cruciais para sobrevivência no hospedeiro mamífero.

Abstract: Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a single flagellum, connected to the body through the flagellum adhesion zone and the basal body. This cellular structure has been shown to be crucial for the motility, cell division and survival of Trypanosomatids. In the same way, proteins associated with the cytoskeleton are important for the maintenance of morphology, therefore, they can compromise the development of the parasite. The characterization of probable cytoskeletal/flagellar proteins of T. cruzi will be useful, as it allows identify the role of these proteins for molecular biology, in addition to determining the flagellar components with common and divergent functions among Trypanosomatids. In Trypanosoma brucei, it has already been shown that the flagellum participates in important biological processes such as duplication and differentiation of the parasite, in addition to apparently being important for the infection of the host. However, in T. cruzi there are few functionally characterized flagellum proteins. The flagellum, despite having a conserved microscopic structure, may have significant differences in the function of orthologous genes presenting specific functions for the species or forms of the parasite. Efforts to functionally characterize some T. cruzi proteins, including those of flagella, have been made using gene overexpression technologies, classical knock-out and transcriptome analysis. The lack of complete characterization of genes is due in part to the existence of few tools for genetic manipulation of T. cruzi. With the development of the editing tool based on the CRISPR/Cas9 system, it allowed the characterization of the phenotypic changes of 2 proteins related to the cytoskeleton. We performed the interruption of the TcTrypanin and TcKharon genes. TcTrypanin -/- mutants show significant changes, such as a reduction in growth rate, differentiation into metacyclic trypomastigotes (MT) and infection in cell monolayers in vitro, in addition to a drop in motility and changes in morphology. This is the first axoneme and cytoskeleton-associated protein characterized in T. cruzi. Kharon -/- mutants showed a pronounced morphological change in epimastigote and metacyclic trypomastigote forms, this change in morphology causes a decrease in growth without affecting differentiation. The proteins TcKharon-1::GFP as well as TcTrypanin::GFP were detected in cytoskeletal fraction when overexpressed in wild-type parasites, and their expression in mutant parasites were able to reverse the phenotypic alterations of the respective disrupted genes. Unlike T. brucei or Leishmania mexicana deficient in the expression of Trypanin or Kharon, both T. cruzi mutants were able to complete the life cycle, that is, even the stages present in the mammalian host were viable. These data highlight the need to identify the core of cytoskeleton/flagella proteins crucial for survival in the mammalian host.