Regulation of the NAD+ metabolism in bacteria by L-Glutamine, NAD+ and PII proteins&NBSP

Abstract

Resumo: Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD)+ é um metabólito central que participa das principais reações redox junto com diversas enzimas oxidorredutases. Ainda, NAD+ é usado como substrato por ADP-ribosil transferases, sirtuínas e DNA ligases NAD+- dependentes. A biossíntese de NAD+ é uma das rotas fundamentais de biossíntese e a ubíqua NAD+ sintetase (NadE) catalisa seu último passo. Duas diferentes classes da NadE foram descritas até agora: dimérica com domínio único e dependente de amônio chamada de NadENH3 e a octamérica com dois domínios, um de hidrólise da L-glutamina e outro de síntese do NAD+, chamada de NadEGln. A presença de múltiplas isoformas é relativamente comum em procariotos. Neste trabalho, identificamos um novo grupo de NadE diméricas dependentes de glutamina em bactéria. A determinação da preferência de substrato e a análise estrutural sugerem que as enzimas NadEGln podem constituir intermediários evolutivos entre as NadENH3 diméricas e as NadEGln octaméricas. A caracterização de isoformas adicionais no organismo diazotrófico Azospirillum brasilense junto com a determinação dos níveis de glutamina em resposta ao choque de amônio nos levou a propor um modelo em que essas diferentes isoformas da NadE se tornam ativas de acordo com a disponibilidade de nitrogênio. Isso pode explicar a pressão seletiva que corrobora a coexistência de múltiplas isoformas da NadE em diversos procariotos. Adicionalmente, análise de vizinhança gênica realizada anteriormente indica que o gene nadEGln é frequentemente agrupado com o gene que codifica para as proteínas transdutoras de sinal PII, sugerindo uma relação funcional entre PII e NadE em resposta ao estado nutricional e a razão carbono/nitrogênio na célula bacteriana. Proteínas PII são reguladoras que sinalizam os níveis de energia e de nitrogênio através da ligação dos metabólitos ATP, ADP e 2-oxoglutarato. Para investigar essa hipótese, cromatografia de afinidade e ensaios de interferometria biolayer foram realizados para mostrar que a PII e a NadEGln interagem in vitro. Ensaios de atividade da enzima NadEGln demonstram que a formação do complexo alivia a inibição por retroalimentação negativa do produto da reação, o NAD+. Além do mais, 2- oxoglutarato, um efetor alostérico de PII e indicador do nível de nitrogênio celular, inibiu a formação do complexo PII-NadEGln dentro de níveis fisiológicos. Análise bioinformática sugere que esse mecanismo é conservado em bactérias distantes filogeneticamente. Os resultados dessa tese indicam uma relação funcional entre os efetores de PII ATP, ADP e 2-oxoglutarato e o inibidor da NadEGln, o NAD+, representando um novo eixo de regulação metabólica, que balança os níveis de nitrogênio e carbono. Concluindo, nossas descobertas apontam que PII age como uma subunidade regulatória dissociável da NadEGln, desse modo permitindo o controle da biossíntese de NAD+ de acordo com o estado nutricional da célula bacteriana. Palavras chave: NAD+, metabolismo de NAD+, balanço de nitrogênio, balanço de carbono, ATP, ADP, 2-oxoglutarato, NadE, PII, glutamina.

Abstract: NAD+ is a central metabolite participating in core metabolic redox reactions together with several oxidoreductase enzymes. Likewise, NAD+ is used as a substrate by ADPribosyl transferases, sirtuins, and the NAD+-dependent DNA ligase. NAD+ biosynthesis is one of the most fundamental biochemical pathways and the ubiquitous NAD+ synthetase (NadE) catalyzes its final step. Two different classes of NadE have been described to date: dimeric single-domain ammonium-dependent NadENH3 and octameric two-domain glutamine-dependent NadEGln. The presence of multiple NadE isoforms is relatively common in prokaryotes. Here, we identified a novel dimeric group of NadEGln in bacteria. Substrate preferences and structural analyses suggested that dimeric NadEGln enzymes may constitute evolutionary intermediates between dimeric NadENH3 and octameric NadEGln. The characterization of additional NadE isoforms in the diazotrophic bacterium Azospirillum brasilense along with the determination of intracellular glutamine levels in response to an ammonium shock led us to propose a model in which these different NadE isoforms became active accordingly to the availability of nitrogen. These data may explain the selective pressures that support the coexistence of multiple isoforms of NadE in several prokaryotes. Additionally, previous gene neighborhood analysis indicated that bacterial nadEGln gene is frequently clustered with the gene encoding the PII signal transduction proteins, suggesting a functional relationship between these proteins in response to the nutritional status and the carbon/nitrogen ratio of the bacterial cell. PII proteins are regulators that sense energy and nitrogen levels through the binding of the metabolites ATP, ADP, and 2-oxoglutarate. To investigate this hypothesis, ligand-fishing affinity chromatography and a biolayer interferometry assay were performed to show PII and NadEGln interaction in vitro. NadEGln enzyme activity demonstrates that this complex relieves NadEGln from negative feedback inhibition by its product NAD+. Moreover, 2- oxoglutarate, a PII allosteric effector and cellular nitrogen level indicator, inhibited the formation of the PII-NadEGln complex within a physiological range. Bioinformatic analyses suggest that this mechanism is conserved in distantly related bacteria. Our results indicate an interplay between the PII effectors ATP, ADP, and 2-OG, and the NadEGln inhibitor NAD+ that represents a novel metabolic hub, balancing the levels of nitrogen and carbon. Our findings support that PII proteins act as a dissociable regulatory subunit of NadEGln, thereby enabling the control of NAD+ biosynthesis according to the nutritional status of the bacterial cell. Key words: NAD, NAD metabolism, nitrogen balance, carbon balance, ATP, ADP, 2- oxoglutarate, NadE, PII, glutamine

ZUSAMMENFASSUNG: NAD+ ist ein zentrales Metabolit, welches zusammen mit mehreren Oxidoreduktase- Enzymen an Kernstoffwechsel-Redox-Reaktionen teilnimmt. Ebenso wird NAD+ von ADP-Ribosyltransferasen, Sirtuinen und der NAD+-abhängigen DNA-Ligase als Substrat verwendet. Die NAD+-Biosynthese ist einer der grundlegendsten biochemischen Wege, in welchem die ubiquitäre NAD+-Synthetase (NadE) den letzten Schritt katalysiert. Bisher wurden zwei verschiedene Klassen von NadE Enzymen beschrieben: NadENH3 - von Ammonium abhängige Dimere mit einer enzymatischen Domäne und NadEGln - von Glutamin abhängige Oktamere mit zwei Domänen. Das Vorhandensein mehrerer NadE-Isoformen ist bei Prokaryonten relativ häufig. In dieser Arbeit wurde eine neue dimere Gruppe von NadEGln Enzymen in Bakterien identifiziert. Substratpräferenzen und Strukturanalysen legen nahe, dass dimere NadEGln-Enzyme evolutionäre Zwischenstufen zwischen dimeren NadENH3 und oktameren NadEGln darstellen. Die Charakterisierung zusätzlicher NadE-Isoformen in dem diazotrophen Bakterium Azospirillum brasilense zusammen mit der Bestimmung des intrazellulären Glutaminspiegels in Reaktion auf einen Ammoniumschock führte uns dazu, ein Modell vorzuschlagen, in dem diese verschiedenen NadE-Isoformen entsprechend der Verfügbarkeit von Stickstoff aktiv werden. Diese Daten können die selektiven Faktoren erklären, die die Koexistenz mehrerer NadE-Isoformen in Prokaryonten hervorgerufen haben. Darüber hinaus deuten Analyse zur genetischen Nachbarschaft darauf hin, dass das bakterielle nadEGln-Gen häufig mit einem Gen geclustert ist, das ein PIISignaltransduktionsprotein kodiert, was auf eine funktionelle Beziehung zwischen diesen Proteinen als Reaktion auf den Ernährungszustand und des Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnisses der Bakterienzelle hindeutet. PII-Proteine sind Regulatoren, die den Energie- und Stickstoffgehalt durch die Bindung der Metaboliten ATP, ADP und 2-Oxoglutarat wahrnehmen. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurden "ligand-fishing affinity" Chromatografie und ein "Biolayer interferometry assay" durchgeführt, um PII- und NadEGln-Interaktion in vitro zu zeigen. Die Enzymtests zeigten, dass dieser Komplex NadEGln von der negativen Rückkopplungshemmung durch sein Produkt NAD+ schützt. Darüber hinaus zeigte sich, dass 2-Oxoglutarat, ein allosterischer PII-Effektor und zellulärer Indikator der Stickstoffkonzentration, die Bildung des PII-NadEGln-Komplexes schon in physiologischen Konzentrationen hemmt. Bioinformatische Analysen deuten darauf hin, dass dieser Mechanismus auch in entfernt verwandten Bakterien konserviert ist. Diese Ergebnisse deuten auf ein Zusammenspiel zwischen den PII-Effektormolekülen ATP, ADP und 2-OG und dem NadEGln-Inhibitor NAD+ hin, welches einen neuartigen metabolischen Knotenpunkt im Stickstoff- und Kohlenstoff-Stoffwechsel darstellt. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, dass PII-Proteine als eine dissoziierbare regulatorische Untereinheit von NadEGln wirken und dadurch die Steuerung der NAD+-Biosynthese entsprechend dem Ernährungszustand der Bakterienzelle bewerkstelligen. Schlüsselwörter: NAD, NAD-Stoffwechsel, Stickstoffbilanz, Kohlenstoffbilanz, ATP, ADP, 2-Oxoglutarat, NadE, PII, Glutamin.