Análise da modulação da expressão gênica de Trypanosoma cruzi ao longo da curva de crescimento e em diferentes condições de estresse

Abstract

Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente da doença de Chagas, sendo um protozoário flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida. Este parasita está distribuído em 21 países. Possui um ciclo de vida bastante complexo com diferenças morfológicas ultra-estruturais, funcionais e bioquímicas, apresentando sob diferentes formas nos hospedeiros invertebrados e vertebrados. A forma epimastigota é não infectiva e proliferativa, encontrada naturalmente no trato digestivo do inseto vetor, podendo ser cultivada in vitro. Um importante passo para melhor entendimento desse parasita é estudo das suas características celulares e moleculares apresentadas durante a sua curva de crescimento. Nesse trabalho foi apresentada uma visão global do perfil de expressão gênica a partir das frações de mRNA total e polissomal ao longo de 10 dias da curva de crescimento de epimastigotas de T. cruzi. Usando a metodologia de RNA-seq, 2491 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados, dos quais 768 foram modulados em ambas as frações. De acordo com os padrões de modulação encontrados, os DEGs foram agrupados em 13 clusters e alguns destes apresentaram enriquecimento de termos de ontologia gênica (GO) indicando os processos biológicos e moleculares envolvidos. Análises do perfil polissomal podem revelar quais genes estão sendo traduzidos em uma determinada condição, assim o padrão de expressão desses mRNAs pode ser diferente nas frações de total e polissomal. No entanto, foi encontrada uma extensa sobreposição dos padrões de modulação para a maioria dos clusters. Claramente durante a fase estacionária o conteúdo de polissomos apresentou uma forte diminuição associado ao surgimento de grânulos de mRNA. Isto sugere que durante esta fase a maioria dos transcritos isolados a partir do colchão de sacarose está provavelmente associada a complexos de mRNA invés de polirribossomos. Isto pode indicar que os mRNAs da fase estacionária podem estar sendo protegidos por esses grânulos para posterior tradução quando o ambiente se tornar novamente favorável. Vários aspectos da curva de crescimento deste parasita foram destacados, principalmente em relação as alterações pelas quais o parasita transita ao longo da fase estacionária. Além disso, foi investigada uma possível via de controle através da concentração de glicose a qual foi proposta a partir de comparações com estudos de Saccharomyces cerevisiae. Para um estudo complementar da curva de crescimento foi realizada uma abordagem de proteômica. Os dados preliminares mostraram uma boa identificação de grupos de proteínas (3.249), a maioria representando uma proteína por grupo. Algumas proteínas diferencialmente expressadas (DEPs) foram detectadas, apesar do baixo poder estatístico das análises. Dentre 68 DEPs identificadas, 21 mostraram correlação no padrão de modulação com os dados de transcritômica. Também foi apresentada uma análise de transcritômica preliminar de epimastigotas em fase estacionária inicial submetidos a diferentes condições nutricionais (PBS, TAU e TAU3AAG) por 1, 2, 4, 6 e 24 horas. Foram identificados 612, 804 e 941 supra-genes diferencialmente expressos nos meios PBS, TAU e TAU3AAG, respectivamente. A maioria dos supra-genes modulados foram comuns nas três condições. Juntos, esses estudos representam uma etapa importante na obtenção de dados em larga escala que geração de conhecimento sobre o comportamento e resposta do parasita em diferentes condições ambientais. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, curva de crescimento, RNA-seq, polissomos, proteômica e estresse.

Abstract: The Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoa that belongs to the Kinetoplastida order and is the etiologic agent of Chagas disease, an endemic illness distributed in 21 countries. The T. cruzi life cycle is complex including morphological, functional and biochemical changes. The epimastigote form is proliferative and non-infective, founded naturally in the insect vector gut and can be cultivated in vitro. An important step to comprehend the T. cruzi biology is the study of cellular and molecular features presented during its growth curve. Here, we show a global view of gene expression profile for total and polysomal RNA fractions along 10 days of the T. cruzi epimastigote growth curve in vitro. A total of 2491 differential expressed genes (DEGs) were established using RNA-Seq approach, of which 768 were modulated in both fractions. According to the modulation pattern, these DEGs were grouped into 13 clusters and some of them show enrichment to important GO terms, indicating molecular and cellular biological processes involved. The polysomal profile might reveal mRNAs that are being translated and their expression pattern could be different from the total RNA fraction, nevertheless, in most clusters we see remarkable overlapped modulation. Moreover, at the stationary phase the polysomal content greatly decline while the RNA granules seems to increase. This suggests that most of mRNAs isolated from sucrose cushion at this growth stage should be associated with granules instead with polyribosomes. This possible indicates that stationary phase mRNAs are being protected by granules for further translation when the environment becomes favorable. We highlight some views on the T. cruzi growth curve, mainly related to the alteration that the parasite pass along the stationary phase. Moreover, a possible sensing pathway for glucose depletion was suggested for T. cruzi based on Saccharomyces cerevisiae studies comparison. Growth curve complementary study was performed using proteomic approach. Preliminary data shows the identification of 3,249 protein groups, mostly representing one protein per group. Some differential expressed proteins (DEPs) were identified, besides the limited statistical power. Among the 68 DEPs identified, 21 showed correlation in their proteomic and transcriptomic modulation pattern. Preliminary transcriptomic analysis of epimastigote in early stationary phase under three nutritional different conditions (PBS, TAU, TAU3AAG) during 1, 2, 4, 6 and 24 hours were also present here. Total of 612, 804 and 941 differential expressed supra-genes were identified in PBS, TAU and TAU3AAG conditions, respectively. Most of supra-genes were common to all treatments. Together, these works represent an important step for large scale data generation that will provide insights into the parasite behavior and response to different environmental conditions. Key-words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, growth curve, RNA-seq, polysomes, proteome and stress.