Aplicabilidade da PCR em tempo real ao diagnóstico da leptospirose humana e ao monitoramento da contaminação ambiental por espécies patogênicas de Leptospira

Abstract

Resumo: cuja sintomatologia é inespecífica. Humanos desenvolvem formas graves de leptospirose e os métodos diagnósticos atuais não são eficazes para a detecção precoce da doença. O uso de um método de PCR em tempo real pode permitir o diagnóstico precoce e a quantificação das bactérias em amostras clínicas; além da quantificação do risco ambiental em amostras de água. Foi demonstrado que o método permite a detecção das leptospiras em amostras de sangue total coletadas nos primeiros seis dias de doença, após os quais a carga bacteriana decai de modo inversamente proporcional ao título de anticorpos. O limite mínimo de detecção foi estimado em 280 GEq/mL. O ponto de corte prognóstico foi estimado em 159 GEq/mL para o desenvolvimento de LPHS, com sensibilidade de 64,3% (IC 95% 35,1-87,2%), especificidade de 68,8% (IC 95% 62,8-74,3%) e acurácia 68,0%. Para óbito, o ponto de corte prognóstico foi definido em 1.181 GEq/mL, com sensibilidade de 76,5% (IC 95% 50,1-93,2%), especificidade de 89,3% (IC 95% 85,0-92,8%) e acurácia de 88,3%. A seleção do kit para extração do DNA e estabelecimento de parâmetros de concentração, volume inicial de amostra e limite mínimo de detecção permitiu a adaptação do método de qPCR para a quantificação das leptospiras em amostras ambientais. O método adaptado foi validado em estudo conduzido com amostras ambientais coletadas na comunidade de Pau da Lima, em Salvador (Bahia, Brasil). Os resultados apontaram maior positividade entre as amostras coletadas em baixa altitude (50% das amostras positivas), bem como entre as amostras coletadas pela manhã em comparação com a tarde (17,7% vs. 5,8%). A positividade foi maior entre amostras de esgoto do que entre amostras de água empoçada (17,7% vs. 5,6%). Também houve diferença de positividade entre as amostras coletadas nos períodos úmido e com umidade intermediária (16,0% vs. 9,7%). Assim, concluímos que o método de qPCR é uma ferramenta útil para o diagnóstico e avaliação prognóstica em pacientes com suspeita clínica de leptospirose. O método também foi eficaz na identificação de possíveis focos de infecção a partir da avaliação de amostras de água coletadas em área endêmica. Palavras-chave: Leptospira, leptospirose, PCR em tempo real, sangue total, carga bacteriana, prognóstico, amostra ambiental de água.

Abstract: are non-specific. Humans develop severe forms of leptospirosis and the current diagnostic methods are not suited for the early diagnosis of the disease. The use of a real-time PCR method allowed for an early diagnosis and bacterial quantification in clinical samples, as well as quantification of environmental burden in water samples. It has been shown that this method allows for the detection of leptospires in whole blood samples obtained during the first six days of illness, after which the bacterial load decrease is inversely proportional to the raise in antibody titer. The lower limit of detection was estimated to be 280 GEq/mL. The prognostic threshold was estimated at 159 GEq/mL for the development of LPHS, with sensitivity of 64.3% (95% CI 35.1- 87.2%), specificity of 68.8% (95% CI 62.8-74.3%) and accuracy of 68.0%. For death, the prognostic threshold was set at 1.181 GEq/mL, with sensitivity of 76.5% (95% CI 50.1-93.2%), specificity of 89.3% (95% CI 85.0-92.8%) and accuracy of 88.3%. Selection of the commercial kit for DNA extraction, and establishment of concentration parameters, initial sample volume and lower limit of detection led to the adaption of the qPCR method to allow for the quantification of leptospires in environmental samples. The adapted method was validated in a study conducted with environmental samples collected in the slum community of Pau da Lima, in Salvador (Bahia, Brazil). Results showed a higher positivity for samples collected at low altitudes (positivity of 50%), as well as for samples collected in the morning when compared to those collected in the afternoon (17.7% vs. 5.8%). Positivity was also higher for sewage than for puddle water (17.7% vs. 5.6%). There was also difference in positivity for samples collected during the wet season when compared to those collected during the period with intermediate humidity (16.0% vs. 9.7%). Therefore, we conclude that the qPCR method is a useful tool for the diagnosis and prognostic evaluation of patients with a clinical suspicion of leptospirosis. The method was also reliable in identifying possible infection sites through the evaluation of water samples collected from an endemic area. Keywords: Leptospira, leptospirosis, real time PCR, whole blood, bacterial load, prognosis, environmental water sample.