Efeitos citotóxicos da interação entre nanopartículas de prata e metais não essenciais em células de hepatocarcinoma humano (HEPG2)

Abstract

Resumo: Devido a intensa produção e incorporação de AgNP em produtos para consumo, espera-se que estas sejam, direta ou indiretamente, liberadas em ambiente naturais, o que representa uma via de exposição em potencial não apenas para a biota, mas também para humanos. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico de AgNP em células e organismos, a co-exposição com contaminantes onipresentes na natureza, como metais, pode induzir efeitos que não podem ser previstos a partir daqueles gerados por exposições isoladas. Nesta tese, as interações toxicológicas entre AgNP e Cd/Hg foram investigadas em células HepG2. No primeiro capítulo, ensaios bioquímicos, microscopia confocal e quantificação intracelular de metais indicaram que as co-exposições resultam em interações toxicológicas, sendo a associação de AgNP+Cd mais tóxica do que AgNP+Hg. Aumentos nos níveis de EROs citosólicas e mitocondrial foram observados após 2-4 h de exposição a AgNP+ Cd/Hg, porém esse efeito foi parcialmente revertido após 24 h de exposição a AgNP+Hg. Ainda, decréscimos da viabilidade celular, metabolismo, proliferação e atividade dos transportadores MDR foram mais pronunciados em células co-expostas aos contaminantes do que aos contaminantes individuais. As co-exposições levaram ao aumento da morte celular, principalmente por necrose, e aumento na concentração intracelular de Hg. Desta forma, interações toxicológicas resultam na potencialização da toxicidade de AgNP, Cd e Hg. Enquanto o aumento intracelular de Hg pode estar relacionado com a maior toxicidade de AgNP+Hg, essa lógica não é válida para os efeitos deletérios observados após a co-exposição a AgNP+Cd. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar mais aprofundadamente os efeitos celulares e moleculares induzidos pela associação entre as AgNP e Cd. A viabilidade celular e relação ADP/ATP foram pouco alteradas após 4 h de exposição; no entanto, esses parâmetros foram substancialmente alterados após 24 h. Os resultados da análise proteômica seguiram o mesmo padrão: enquanto após 4 h as exposições aos contaminantes o proteoma total das células foi pouco alterado, após 24 h de exposição às AgNP e Cd, cerca de 7% e 2% do proteoma total foi desregulado, respectivamente, enquanto 43% deste foi alterado após co-exposição a AgNP+Cd. Resumidamente, a toxicidade desta associação parece estar envolvida com a inativação de Nrf-2, o que pode resultar na redução dos níveis da defesa antioxidante, e proteínas relacionadas aos proteossomos; redução dos níveis de proteínas envolvidas na via glicolítica e aumento nos níveis de proteínas envolvidas com a fosforilação oxidativa e metabolismo de lipídios, o que pode indicar uma tentativa de retorno às condições de homeostase energética. No entanto, essa estratégia de adaptação celular não foi suficiente para reestabelecer a homeostase de ADP/ATP e impedir a morte celular. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre AgNP e metais não essenciais em modelo in vitro. Palavras-chave: AgNP, cádmio, mercúrio, co-exposição, interação, ensaios bioquímicos, proteômica.

Abstract: Due to the increasing production and applications of AgNP in consumer products, AgNP are expected to be, directly or indirectly, released into natural environments, representing a potential threat to the biota and humans. An increasing number of studies have described the toxic potential of AgNP in cells and organisms. However, co-exposure of AgNP with ubiquitous contaminants, such as metals, may result in non-predictable outcomes. In this thesis, toxicological interactions of AgNP, Cd and Hg were investigated in HepG2 cells. In the first chapter, biochemical endpoints, confocal microscopy and intracellular metal concentration indicated that the co-exposures led to toxicological interactions, with AgNP + Cd being more toxic to HepG2 cells than AgNP + Hg. Early (2-4 h) increases of cytosolic and mitochondrial ROS were observed in the cells co-exposed to AgNP + Cd/Hg, in comparison to the control and individual contaminants, but the effect was partially reverted in AgNP + Hg at the end of 24 h-exposure. In addition, decreases of mitochondrial metabolism, cell viability, cell proliferation and ABC-transporters activity were also more pronounced in the co-exposure groups. Foremost, co-exposure to AgNP and metals potentiated cell death (mainly by necrosis) and Hg (but not Cd) intracellular levels. Therefore, toxicological interactions seem to increase the toxicity of AgNP, Cd and Hg. While an increase of Hg uptake might be related to the increase of toxicity after exposure to AgNP+Hg, this logic is not valid for the high toxicity observed after co-exposure to AgNP+Cd. Therefore, the second chapter was conducted to further explore cellular and molecular effects induced by this co-exposure. Cell viability and ADP/ATP ratio were slightly affected after the 4 h exposure to individual and combined exposures. However, these endpoints were strongly altered after 24 h co-exposure to AgNP+Cd compared to the control and individual exposures. The proteomics data followed the same trend: minor deregulation at 4 h-exposure in all groups and 7% (AgNP), 2% (Cd) and 43% (AgNP+Cd) at 24 h-exposure. Briefly, the toxicity induced by AgNP+Cd seems to be involved the inactivation of Nrf-2, which can result in down-regulation of antioxidant defense and proteasome related proteins, down-regulation of glycolysis related proteins and upregulation of oxidative phosphorylation and lipid metabolism proteins. This may indicate an attempt to reestablish homeostasis. Thus, the adaptation strategy was not able to restore ADP/ATP homeostasis and avoid cell death. Overall, this study provides the first insights into cellular outcomes after the co-exposure to AgNP and non-essential metals. Key words: AgNP, cadmium, mercury, co-exposure, interaction, biochemical endpoints, proteomics.