Mecanismos moleculares envolvidos na interação Herbaspirillum seropedicae - gramíneas e adoção da planta modelo Setaria viridis para estudo da interação diazotrofo-gramíneas

Abstract

Resumo: As bactérias promotoras do crescimento de planta (BPCP) estimulam o crescimento vegetal por mecanismos que favorecem a assimilação de nutrientes essenciais do solo, produção de fitohormônios e de substâncias que inibem o crescimento de patógenos, além da fixação biológica de nitrogênio (FBN). As bactérias Herbaspirillum seropedicae e Azospirillum brasilense são fixadores de nitrogênio capazes de colonizar e promover o crescimento de gramíneas. No entanto, os mecanismos moleculares que a bactéria utiliza para gerar os efeitos positivos na planta não são completamente entendidos. O presente trabalho tem como objetivo contribuir para o entendimento da interação entre planta-BPCP. Para isto, tais objetivos incluem: (1) elucidar, através de análise transcritômica, os mecanismos moleculares utilizados por H. seropedicae durante a interação com Triticum aestivum (trigo); (2) avaliar a promoção do crescimento vegetal pela co-inoculação de H. seropedicae e A. brasilense em Setaria viridis (green foxtail), para o desenvolvimento de um novo modelo de estudo da interação planta-bactéria. Na primeira parte deste trabalhado plântulas de T. aestivum, cultivadas de forma axênica em meio hidropônico, foram inoculadas com H. seropedicae. Duas bibliotecas de RNA-seq foram construídas, uma compreendendo as bactérias aderidas às raízes de trigo e outra pelas bactérias planctônicas crescendo em meio Hoagland's, utilizado para o cultivo da planta. Os dados de transcritoma mostraram que H. seropedicae se adere às raízes de trigo provavelmente através de adesinas específicas, ativa o sistema Ntr e os genes nif, além de transportadores ABC específicos e expressa genes do metabolismo de polihidroxialcanoatos, produção e secreção de auxina. Na segunda parte deste trabalho, a promoção do crescimento vegetal por bactérias diazotróficas foi avaliada em diferentes acessos da planta Setaria viridis. S. viridis é uma gramínea modelo para os estudos de fotossíntese do tipo C4. No presente estudo, 32 acessos desta planta foram co-inoculados com bactérias diazotróficas e cultivadas em casa de vegetação, por 40 dias, em condições de baixo (0,5 mM KNO3) ou nenhum nitrogênio. Posteriormente, os parâmetros de crescimento foram avaliados e o genótipo A10.1 foi identificado como o mais responsivo à inoculação tendo aumentado o peso seco e fresco da parte aérea, o comprimento da raiz, o número de raízes laterais e o número de sementes. Ainda, foi demonstrado microscopicamente que H. seropedicae coloniza os tecidos internos da planta e que A. brasilense coloniza a planta epifiticamente e fixa nitrogênio. Em colaboração com o laboratório nacional Brookhaven, nos Estados Unidos, experimentos utilizando o isótopo 13N2 mostraram evidências da fixação biológica de nitrogênio e incorporação deste nitrogênio em S. viridis A10.1. Juntos, os dados deste trabalho trazem novas perspectivas para os estudos da interação H. seropedicae-gramínea e revela genes e mecanismos essenciais para a interação. A adoção da planta modelo S. viridis deve impulsionar os estudos sobre fixação biológica de nitrogênio com objetivo de consolidar o uso da FBN para a produção de cereais como o milho e o trigo. Palavras-chave: Fixação biológica de nitrogênio, H. seropedicae, A. brasilense, RNA-seq, bactérias diazotróficas, bactérias promotoras de crescimento de planta, S. viridis.

Abstract: The plant growth-promoting bacteria (PGPB) stimulate plant growth by mechanisms that increase assimilation of essential nutrients from the soil, phytohormones release and production of substances that inhibit phytopathogens and the biological nitrogen fixation (BNF). Herbaspirillum seropedicae and Azospirillum brasilense are proteobacteria that fix nitrogen and are able to establish an efficient colonization with plants and its benefit in promoting plant growth has already been demonstrated. However, the molecular mechanisms utilized by the bacteria to cause the positive effects to the plant are not completely understood. In the present work we intend to study the mechanisms that contributes to the beneficial plant-bacteria interaction. The main goals include: (1) Transcriptomic analysis of H. seropedicae colonizing T. aestivum roots to identify genes related to bacterial ability of colonizing plant; and (2) evaluate the plant growth promotion of Setaria viridis upon co-inoculation with H. seropedicae and A. brasilense. In the first part of this work T. aestivum seedlings growing hydroponically in Hoagland's cultivation medium were inoculated with H. seropedicae. Two RNA-seq libraries were constructed; one from wheat-rootsattached bacteria (WRA) and another from planktonic bacteria (PLANK) growing in the Hoagland's medium. The transcriptome data showed that H. seropedicae attached to the wheat roots probably through specific adhesins. The bacterial metabolism was adapted to low oxygen concentrations and the nif genes were activated. ABC transporters genes were also expressed, providing insights into specific adaptations. Genes of polyhydroxyalkanoate synthesis were activated and genes related to the ability of promote plant growth, such as phytohormones production were up-regulated. In the second part of this study, the plant growth promotion by diazotrophic bacteria was evaluated in different accessions of Setaria viridis. S. viridis is a grass model for C4-type photosynthesis, and has been extensively employed in studies of plant genetics. Here, 32 accessions were coinoculated with H. seropedicae and A. brasilense in greenhouses during 40 days, under conditions of low (0.5 mM KNO3) or no nitrogen addition. Finally, the S. viridis genotype A10.1 was identified as the most responsive to inoculation with increased fresh and dry shoot weight, total root length, number of lateral roots and number of seeds. Indeed, it was shown that H. seropedicae colonizes the internal tissues of the plant and that A. brasilense epiphytically colonizes the plant and fix nitrogen. In collaboration with the Brookhaven National Laboratory-USA, the utilization of the 13N2 isotope showed evidence of BNF and incorporation of fixed nitrogen in S. viridis A10.1. Together, the results provide new perspectives for the studies of H. seropedicae-grass interaction and reveals genes and essential mechanisms for this interaction. The adoption of the model plant S. viridis should enhance the studies on biological nitrogen fixation with the objective of establishing the use of BNF to increase the production of cereals and uses less chemical nitrogen fertilizers. Key Words: Biological Nitrogen Fixation, H. seropedicae, A. brasilense, RNA-seq, diazotrophic bacteria, plant growth promoting rhizobacteria, S. viridis.