Prospecção metagenômica de biocatalisadores da microbiota de solos da Floresta Atlântica paranaense

Abstract

Resumo: A diversidade bacteriana do solo e seu potencial biotecnologico sao pouco explorados. Dados indicam que 1 g de solo contem mais de 10 bilhoes de micro-organismos distribuidos em milhares de especies. Entretanto, a grande maioria dessas especies sao desconhecidas devido a sua inabilidade de se multiplicar nos meios de cultivo tradicionalmente usados em laboratorio. A Metagenomica tornou possivel o acesso a essa vasta diversidade genetica permitindo a analise direta do DNA de uma comunidade bacteriana e levando a descoberta de novos biocatalisadores. Nesse trabalho sao descritas a construcao de tres bibliotecas metagenomicas, a prospeccao por novos biocatalisadores e a caracterizacao de uma nova lipase identificada nessas bibliotecas. As bibliotecas foram construidas a partir de amostras de solo da Floresta Atlantica Paranaense coletadas em diferentes altitudes. O DNA das amostras de solo foi purificado, reparado e clonado no vetor pCC2FOS. Os fosmideos recombinantes foram transformados na estirpe EPI300 de Escherichia coli gerando as bibliotecas metagenomicas MAF1, MAF2 e MAF3 com 34.560, 29.280 e 36.288 clones, respectivamente. Todos os clones foram analisados quanto a atividade triacil-hidrolasica em tributirina (315 clones positivos), tricaprilina (10 clones positivos) e trioleina (3 clones positivos). Os clones da biblioteca MAF1 tambem foram analisados quanto a atividade de protease (460 clones positivos) e atividade de amilase (4 clones positivos). O DNA inserto dos clones com atividade lipolitica MAF1LP001, MAF1LP018 e MAF1LP090 foram sequenciados, o que permitiu identificar 80 ORFs/genes. A lipase LP001ORF27 foi identificada como membro da familia I das lipases e similaridade proxima a subfamilia termofilica I.5. A enzima purificada apresenta atividade contra diferentes para-nitrofenil-monoacilesteres (pNP monoacilesteres) com atividade maxima (7 U/mg) contra pNP decanoato. LP001ORF27 apresentou atividade do pH 5,0 ao 11,0, com atividade otima em pH 7,0 e nao apresentou dependencia de metais. A temperatura otima de atividade ocorreu na faixa de 50-60oC e a enzima apresentou ativacao termica de 80% apos incubacao por 1 hora a 50oC. A lipase LP018ORF16 nao apresentou similaridade com sequencias de lipases conhecidas e a analise filogenetica sugeriu que ela constitui uma nova familia. Essa enzima tambem demonstrou dependencia da proteina LP018ORF15, provavelmente uma chaperona, para atividade. LP090ORF24 foi identificada como membro da familia I das lipases, proxima a subfamilia I.2, e tambem apresenta similaridade com uma poli-hidroxialcanoato (PHA) depolimerase. Proximo a LP090ORF24 foi identificado um gene que codifica uma Ą-amilase. Finalmente, a analise da sequencia dessa proteina sugeriu que ela contem um dominio de ciclodextrina glicosiltansferase (CGTase). Os resultados obtidos nesse trabalho confirmam o potencial da Metagenomica para a descoberta de novas enzimas de importancia biotecnologica.