Sensibilidade de isolados de Elsinoe ampelina à fungicidas e avaliação do potencial de agentes biológicos no controle da antracnose da videira no Brasil

Abstract

Resumo: A antracnose da videira, causada por Elsinoe ampelina, é uma doença importante capaz de gerar perdas significativas na produção de uva. O controle é majoritariamente químico, com aplicações sucessivas de fungicidas sintéticos. Contudo, o uso sistemático e repetitivo de mesmo ingrediente ativo pode ocasionar a seleção de populações resistentes. Diante disso, o controle o biológico surge como alternativa segura, sustentável e eficiente a ser incorporado ao manejo de doenças de plantas. Entretanto, para E. ampelina, estudos investigando a sensibilidade à fungicidas e a eficácia de agentes biológicos no controle do patógeno são inexistentes. Neste contexto, esta dissertação teve como objetivos: (i) avaliar a sensibilidade e classificar os fenótipos de 105 isolados de E. ampelina provenientes de quatro estados brasileiros (RS, SC, PR e SP) aos fungicidas tiofanato-metílico (TM – FRAC 1), difenoconazol (DF – FRAC 3) e azoxistrobina (AZ – FRAC 11); (ii) realizar análises filogenéticas com base nas regiões ITS e TEF1-a de parte dos isolados; (iii) avaliar a ocorrência das principais mutações relacionadas a redução de sensibilidade à TM e DF e (iv) investigar o potencial de agentes de controle biológico (BCA’s) na inibição de estruturas infectivas do patógeno. A caracterização da sensibilidade foi realizada por ensaios de dose discriminatória (1 e 100 µg.mL-¹ para TM; 0,3 µg.mL-¹ para DF; e 1 µg.mL-¹ para AZ) e, para uma subamostra, pela determinação da EC50 para TM e DF. Pela análise filogenética os isolados foram identificados como E. ampelina, formando um grupo monofilético suportado por 100% de BT e 0,99 de PP. Os resultados indicaram que AZ foi eficaz contra todos os isolados testados, enquanto para DF, 14,3% apresentaram sensibilidade reduzida e, para TM, 60% mostraram redução de sensibilidade, incluindo fenótipos com provável resistência múltipla a TM e DF. Ensaios de patogenicidade confirmaram a agressividade sem diferenciar isolados com fenótipos diferentes em relação à sensibilidade a fungicidas. Sequencias parciais dos genes da ß-tubulina e CYP51 de 8 isolados com diferentes fenótipos à TM, e 5 isolados com diferentes fenótipos à DF, respectivamente, foram submetidos a análises moleculares para verificação da ocorrência de mutações pontuais. Para DF, não foram observadas substituições de aminoácidos nas sequências avaliadas de CYP51. Para TM, mutações nos códons 198 (E198K) e 200 (F200Y) da ß-tubulina foram observadas em isolados considerados altamente resistentes e em dois isolados pouco resistentes, enquanto em um isolados pouco resistente, a mutação L240F, conferiu menor redução de sensibilidade ao fungicida. Na segunda etapa, avaliou-se o potencial de BCA’s, incluindo isolados endofíticos e epifíticos de frutíferas e produtos comerciais, em ensaios in vitro de cultivo pareado, meio fundente, ação de metabólitos termoestáveis e compostos voláteis, visando à inibição do crescimento micelial (ICM) e da germinação de conídios (IG). Entre os produtos comerciais, Serenade®, NoNema® e Zigurat® apresentaram maior eficiência no controle das estruturas infectivas. Entre os isolados endofíticos, Paenibacillus polymyxa (isolados 7 e 37) destacou-se, com desempenho equivalente ou superior a alguns produtos formulados, especialmente na inibição da germinação de conídios (IG > 83%) e no cultivo pareado e meio fundente (ICM = 72,9% e até 100%). Compostos voláteis apresentaram eficácia limitada. Os resultados obtidos evidenciam de forma inédita a variabilidade fenotípica de E. ampelina frente a fungicidas de diferentes grupos químicos, a ocorrência de mutações pontuais conferindo resistência à TM, o potencial de resistência múltipla na população avaliada e demonstram a eficácia de BCA’s no controle do patógeno. Os estudos com fungicidas serão base para nortear a escolha de ativos para controle da doença e reforçam a necessidade de monitoramento contínuo da sensibilidade populacional. Em relação aos biológicos, o trabalho sugere opções de produtos comerciais e novos agentes que poderão ser integrados em programas de manejo sustentável da antracnose da videira

Abstract: Grapevine anthracnose, caused by Elsinoe ampelina, is an important disease capable of causing significant yield losses. Control is largely chemical, relying on successive applications of synthetic fungicides; however, systematic and repeated use of the same active ingredient can select for resistant populations. In this context, biological control emerges as a safe, sustainable, and effective alternative to be integrated into plant disease management. Nevertheless, for E. ampelina, studies on fungicide sensitivity and on the efficacy of biological agents against the pathogen are lacking. This dissertation aimed to: (i) evaluate sensitivity and classify phenotypes of 105 E. ampelina isolates from four Brazilian states (Rio Grande do Sul—RS, Santa Catarina—SC, Paraná—PR, and São Paulo—SP) to thiophanate-methyl (TM, FRAC 1), difenoconazole (DF, FRAC 3), and azoxystrobin (AZ, FRAC 11); (ii) perform phylogenetic analyses based on ITS and TEF1-a regions for a subset of isolates; (iii) assess the occurrence of key mutations associated with reduced sensitivity to TM and DF; and (iv) investigate the potential of biological control agents (BCAs) to inhibit infective structures of the pathogen. Sensitivity was characterized using discriminatory-dose assays (TM: 1 and 100 µg·mL-¹; DF: 0.3 µg·mL-¹; AZ: 1 µg·mL-¹) and, for a subsample, by estimating EC50 for TM and DF. Phylogenetic analysis identified all isolates as E. ampelina, forming a monophyletic group strongly supported (bootstrap = 100%; posterior probability = 0.99). Results indicated that AZ was effective against all isolates tested, whereas for DF, 14.3% showed reduced sensitivity and, for TM, 60% showed reduced sensitivity—including phenotypes with likely multiple resistance to TM and DF. Pathogenicity assays confirmed aggressiveness but did not differentiate isolates by fungicide-sensitivity phenotype. Partial sequences of the ß-tubulin and CYP51 genes from eight isolates with differing TM phenotypes and five with differing DF phenotypes, respectively, were analyzed for point mutations. For DF, no amino-acid substitutions were observed in the CYP51 sequences examined. For TM, mutations at ß-tubulin codons 198 (E198K) and 200 (F200Y) were found in highly resistant isolates and in two low-resistance isolates, whereas in one low-resistance isolate the L240F mutation conferred only a minor reduction in sensitivity. In a second step, the potential of BCAs—comprising endophytic and epiphytic isolates from fruit crops and commercial products—was evaluated in vitro using dual-culture and cellophane membrane assays, as well as the activity of thermostable metabolites and volatile compounds, targeting inhibition of mycelial growth (MGI) and conidial germination (GI). Among commercial products, Serenade®, No-Nema®, and Zigurat® showed the greatest efficacy against infective structures. Among endophytes, Paenibacillus polymyxa (isolates 7 and 37) stood out, performing as well as or better than some formulated products, particularly for GI inhibition (GI > 83%) and in dual-culture/cellophane assays (MGI = 72.9% and up to 100%). Volatile compounds showed limited efficacy. Overall, the findings provide the first evidence of phenotypic variability of E. ampelina to fungicides from different chemical groups, document point mutations conferring resistance to TM, indicate the potential for multiple resistance in the evaluated population, and demonstrate the efficacy of BCAs against the pathogen. The fungicide results will guide the selection of actives for disease control and underscore the need for continuous monitoring of population sensitivity. With respect to biologicals, the work points to commercial products and new candidate agents that can be integrated into sustainable management programs for grapevine anthracnose