Embriogênese somática de Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis e Pinus taeda

Abstract

Resumo: O objetivo dessa dissertação foi a determinação da temperatura adequada para a indução da embriogênese somática em famílias de Pinus taeda e Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis (PEExPCH), assim como a avaliação do efeito do Gelrite®, da sacarose, maltose e do ácido abscísico (ABA) na maturação de embriões somáticos. Além disso foi avaliado o efeito da exposição de massas próembriogênicas à radiação UV-C durante a fase de proliferação e testados meios de cultura específicos (mLV e DCR) para o enraizamento in vitro e o desenvolvimento da parte aérea de P. taeda. Megagametófitos imaturos de oito familias do híbrido (PEExPCH) e duas de P. taeda foram cultivados a 23 °C, 26 °C e 28 °C em meio de cultura mLV (Nunes et al., 2018) com 500 mg·L-1 de glutamina, 1g·L-1 de caseína hidrolisada, 20 g·L-1 de sacarose, 4 g·L-1 de Gelrite®, 4,5 µM 6-BAP e 9 µM 2,4-D. Seis familias formaram massas pro-embriogênicas (MPE), sendo quatro a 23°C com porcentagem média de indução de 0,7 a 6,6%, três a 26 °C com 0,5 a 18,5%, e uma a 28 °C com 10% de indução. Dentre as familias estudadas, duas de P. taeda formaram linhagens de massas embriogênicas, uma a 23 °C (ADAMI18LN1), e outra a 26 °C que formou duas linhagens (ADAMI19LN1 e ADAMI19LN2). Na etapa de maturação avaliou-se o efeito de concentrações de Gelrite®, sacarose, maltose, ABA e carvão ativado. Em seguida, os embriões foram transferidos a meio mLV sem reguladores vegetais. As culturas foram mantidas no escuro a 23±2ºC e, após 90 dias, foram avaliados o número médio de embriões somáticos cotiledonares (eSC) por placa, a porcentagem de conversão dos embriões em plântulas, assim como de embriões normais e anormais em função dos tratamentos de maturação. Para a linhagem ESJA ECL2 (PEExPCH), o cultivo em meio de maturação contendo 40 µM ABA, 60 g·L-1 de maltose e 9 g·L-1 de Gelrite® seguido do meio de conversão, permitiu a conversão de 61,1% dos eSC e destes 50% eram normais e 16,5% anormais. Para a linhagem C1L31LN02, 90% dos embriões cotiledonares obtidos no meio de maturação com 40 µM ABA, 30 g·L-1 de sacarose e 9 g·L-1 de Gelrite® foram convertidos. Para P. taeda, os maiores números médios de eSC/placa: foram obtidos quando o meio de maturação continha 40µM ABA, 60 g·L-1 de maltose e 9 g·L-1 de Gelrite®: ADAMI19LN01 (31), ADAMI18LN01 (26) e ADAMI19LN02 (23). As porcentagens de conversão e de eSC normais também foram maiores nesse tratamento (entre 86,3 e 94% de conversão e 79% de eSC normais formando plântulas) para as mesmas linhagens. O enraizamento e crescimento das plântulas de ADAMI19LN02 foi obtido nos meios mLV e DCR (Gupta e Durzan, 1985) adicionados de 1,07 µM ANA, 2,56 µM AIB, 20 g·L-1 de sacarose, 2,5 g·L-1 de carvão ativado e 4 g·L-1 de Gelrite®, sem diferença estatística entre os dois meios. Para estudar o efeito da exposição de MPE a radiação UV-C, foram utilizadas as linhagens do híbrido ESJA ECL2 e C1L31LN02. Estas, ao serem expostas a radiação UV-C por 15 e 25 minutos, perderam a competência embriogênica assim como a capacidade de proliferação, que foi reduzida drasticamente após 3 e 6 semanas em meio mLV. Em conclusão, foi possível desenvolver um protocolo de embriogênese somática para PEExPCH e para P. taeda em que foi alcançado o desenvolvimento da parte aérea dos embriões. Além disso, foi demostrado que a exposição à luz UV-C afeta negativamente a conversão das massas pró-embriogênicas

Abstract: The aim of this study was to determine the optimal temperature for inducing somatic embryogenesis in families of Pinus taeda and Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis (PEExPCH). Additionally, the influence of Gelrite®, sucrose, maltose, and abscisic acid (ABA) on the maturation of somatic embryos was assessed. Furthermore, the impact of exposing pro-embryogenic masses to UV-C radiation during the proliferation phase was examined. Specific culture media (mLV and DCR) were also tested for in vitro rooting and aerial part development of P. taeda. This comprehensive investigation aims to optimize the somatic embryogenesis process and subsequent seedling development in these specific Pinus species. Immature megagametophytes from eight families of the hybrid Pinus elliottii var. elliottii. x Pinus caribaea var. hondurensis (PEExPCH) and two from Pinus taeda were grown at 23, 26 and 28 °C in mLV culture medium (Nunes et al., 2018) with 500 mg-L-1 glutamine, 1 g-L -1 casein hydrolysate, 20 g-L -1 sucrose, 4 g-L -1 Gelrite®, 4.5 µM 6-BAP and 9 µM 2,4-D. Six families formed pro-embryogenic masses (PEMs), four at 23°C with an average induction percentage of 0.7 to 6.6%, three at 26°C with 0.5 to 18.5%, and one at 28°C with 10% induction. Among the families, two of P. taeda formed embryogenic mass lineages, one at 23 °C (ADAMI18LN1), and another at 26 °C which formed two lineages (ADAMI19LN1 and ADAMI19LN2). At the maturation stage, the effect of concentrations of Gelrite®, sucrose, maltose, abscisic acid (ABA) and activated charcoal was evaluated. The embryos were then transferred to mLV medium without plant regulators. The cultures were kept in the dark at 23±2ºC and, after 90 days, the average number of cotyledonary somatic embryos (CSE) per plate, the percentage of embryos converted into seedlings, as well as normal and abnormal embryos, were evaluated in function of the maturation treatments. For the ESJA ECL2 strain (PEExPCH), cultivation in maturation medium containing 40 µM ABA, 60 g-L -1 maltose and 9 g-L -1 Gelrite® followed by transfer on conversion medium led to the conversion of 61.1% of the CSE, of which 50% were normal and 16.5% abnormal. For the ESJA ECL2 strain (PEExPCH), cultivation on maturation medium containing 40 µM ABA, 60 g-L -1 maltose and 9 g-L -1 Gelrite® followed by the conversion medium enabled 61.1% of the CSE to be converted, of which 50% were normal and 16.5% abnormal. For the C1L31LN02 strain, 90% of the cotyledonary embryos obtained in the maturation medium with 40 µM ABA, 30 g-L -1 sucrose and 9 g-L -1 Gelrite® were converted. For P. taeda, the highest average numbers of ESC/plate were obtained when the maturation medium contained 40 µM ABA, 60 g-L -1 maltose and 9 g-L -1 Gelrite®: ADAMI19LN01 (31), ADAMI18LN01 (26) and ADAMI19LN02 (23) and the percentages of conversion and normal ESC were also higher (between 86.3 and 94% conversion and 79% normal CSE forming seedlings) for the same strains. Rooting and seedling growth of ADAMI19LN02 were observed on mLV and DCR (Gupta and Durzan, 1985) media supplemented with 1.07 µM NAA, 2.56 µM IBA, 20 g-L -1 sucrose, 2.5 g-L -1 activated charcoal and 4 g-L -1 Gelrite® without statistical difference between both media. To study the effect of exposing PEM to UV-C radiation, the ESJA ECL2 and C1L31LN02 hybrid strains were used. When exposed to UV-C for 15 and 25 minutes, they lost their embryogenic competence and proliferation capacity, which was drastically reduced after 3 and 6 weeks in mLV medium. In conclusion, it was possible to develop a somatic embryogenesis protocol for PEExPCH and for P. taeda in development of the aerial part of the embryos was achieved. In addition, it was shown that exposure to UV-C light negatively affects the conversion of pro-embryogenic masses