Estudos in vitro de uma rara orquídea da flora do Paraná, Eltroplectris paranaënsis (Orchidaceae: Spiranthinae) : efeitos da glutamina e da ventilação natural sobre a morfoanatomia e fisiologia

Abstract

Resumo: Spiranthinae (Orchidaceae: Orchidoideae: Cranichidae) é a subtribo com maior riqueza de espécies de orquídeas terrestres Neotropicais, com mais de 500 espécies em 40 gêneros. Dentre esses, Eltroplectris Raf. conta com 11 espécies nativas do Brasil, distribuídas pelos domínios da Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica. Recém descrita para a Flora do Estado do Paraná, Eltroplectris paranaënsis Engels & E.C.Smidt é uma orquídea de pequeno porte e inflorescência parviflora com flores verde-claras e brancas. A espécie habita a região de sub-bosque da Mata Atlântica (Floresta Nebular) e, devido à área de ocorrência restrita e população extremamente reduzida, atende aos critérios da lista vermelha da IUCN para ser classificada como "Criticamente em Perigo". Os estudos in vitro acerca da germinação, morfogênese e estado fotossintético das plantas são métodos eficientes para a compreensão das necessidades nutricionais e fisiológicas das orquídeas, e auxiliam na sua conservação ex situ, além de agregarem conhecimento sobre essas espécies ainda negligenciadas pela ciência. No Capítulo I foi abordada a germinação in vitro de E. paranaënsis em resposta a duas composições de meio de cultura, WPM e MS/2. A maior taxa de germinação foi obtida para o meio WPM aos 210 dias de cultivo, chegando a 50,8%. O meio MS/2 apresentou a maior mortalidade de protocormos. A anatomia dos estágios de germinação revelou um rápido acúmulo de amido nos tecidos dos protocormos, provavelmente um requisito para o desenvolvimento do embrião e rompimento da testa da semente. Estômatos ciclocíticos foram observados pela primeira vez em uma orquídea da tribo Cranichidae. Ainda nesse capítulo, as plantas foram cultivadas in vitro sob suplementação de glutamina em duas concentrações (0; 6,8 e 13,6 mM), a fim de avaliar os efeitos desse aminoácido sobre o crescimento e acúmulo de pigmentos fotossintetizantes das plantas. As maiores ocorrências de escurecimento dos tecidos foram observadas no tratamento sem adição de glutamina, caracterizadas pela presença de folhas e ápices radiculares com coloração amarronzada. Os parâmetros de comprimento da maior folha e altura do meristema caulinar foram afetados positivamente pela suplementação de glutamina, sem diferença entre os tratamentos de 6,8 e 13,6 mM. As plantas cultivadas sem glutamina apresentaram menor acúmulo de clorofila a, carotenoides e xantofilas. Nas raízes, foi observado maior desenvolvimento dos polos de protoxilema do cilindro vascular e maior acúmulo de amido nas plantas cultivadas sob suplementação de glutamina. Os efeitos benéficos da suplementação de glutamina sobre a morfogênese das plantas in vitro são esperados devido a possibilidade de abreviação da rota de incorporação de nitrogênio nos tecidos vegetais, além de ser uma biomolécula essencial para a síntese de diversos outros compostos, enzimas e componentes estruturais, como clorofilas. E. paranaënsis é uma planta humícola que habita a camada de serrapilheira, e, portanto, tem acesso aos compostos orgânicos oriundos da degradação das folhas do dossel, e provavelmente está adaptada à crescer em condições de maior aporte de nitrogênio orgânico. O Capítulo II trata sobre a análise do estado fotossintético de E. paranaënsis. Em conjunto com a avaliação do crescimento, as plantas de foram submetidas à análise de gases e fluorescência da clorofila em dois momentos: 1) 60 dias de cultivo in vitro em diferentes concentrações de glutamina e ventilação natural (VN); 2) seis meses de cultivo ex vitro em casa de vegetação. A glutamina influencia positivamente o comprimento foliar e número de raízes; entretanto, a VN é prejudicial para a formação das raízes, com várias ocorrências de interrupção do crescimento. Sob VN, foi observado aumento de F0 e queda de Fv/Fm, o que indica danos causados ao Fotossistema II. Os parâmetros de dispersão de energia (NPQ e Y(NPQ)) também foram reduzidos em VN. Os frascos ventilados perdem água mais rapidamente, aumentando o potencial osmótico do meio de cultura, o que pode induzir estresse osmótico e danificar a maquinaria fotossintética. Os dados também apontam para uma falha na rota de dispersão de energia, o que pode estar relacionado com insuficiência na produção de carotenoides. Esses resultados sugerem que E. paranaënsis é sensível à baixa umidade ambiental, e, portanto, o uso de frascos vedados é recomendável para seu cultivo in vitro. A avaliação da aclimatização demonstrou elevada plasticidade fisiológica de E. paranaënsis, pois todos os parâmetros da fotossíntese ficaram idênticos entre as plantas, independentemente do tratamento ao qual haviam sido submetidas anteriormente. A transpiração e condutância estomática de todas as plantas foi igual a zero, o que indica que os estômatos permaneceram fechados durante todo o período de análise. Dessa forma, conclui-se que E. paranaënsis provavelmente realiza fotossíntese tipo CAM, sendo que novos estudos devem ser realizados para investigar o comportamento fotossintético da espécie. Ao final, nos meses de Janeiro e Fevereiro (2025), várias plantas entraram em florescimento, e as cápsulas se desenvolveram corretamente. Dessa forma, esse trabalho descreveu também o ciclo de vida de Eltroplectris paranaënsis, da germinação de sementes à maturação das cápsulas. A capacidade de florescimento e produção de cápsulas demonstra que as plantas de E. paranaënsis produzidas in vitro são fisiologicamente funcionais e estão aptas para reintrodução no ambiente natural, podendo ser utilizadas no resgate dessa rara espécie

Abstract: Spiranthinae (Orchidaceae: Orchidoideae: Cranichidae) is the subtribe with the highest species richness of Neotropical terrestrial orchids, with more than 500 species amongst 40 genera. Among them, Eltroplectris Raf. has 11 species native to Brazil, distributed along the biomes of Amazon, Caatinga, Cerrado and the Atlantic Rainforest. Recently described for the Paraná State Flora, Eltroplectris paranaënsis Engels & E.C.Smidt is a small orchid with parviflorous inflorescence of greenish-white flowers. The species inhabits the understorey of the Atlantic Rainforest (Cloud Forest) and, due to restricted site and extremely reduced population size, it fills IUNC Red List criteria to be evaluated as Critically Endangered. In vitro studies regarding germination, morphogenesis, and photosynthetic state of the plants are efficient methods to enable the comprehension of nutritional and physiological needs of orchids, and aid on their ex vitro conservation, in addition to building knowledge about those species still neglected by science. Chapter I regarded the in vitro germination of E. paranaënsis in response to two culture media composition, WPM and MS/2. The highest germination rate was obtained on WPM medium at 210 days of cultivation, reaching 50.8%. MS/2 medium had the highest protocorm mortality. Anatomy of the germination stages revealed a rapid accumulation of starch in the protocorm tissues, probably a requirement for embryo development and testa rupture. Cyclocytic stomata were seen for the first time in an orchid of the Cranichidae tribe. Still in this Chapter, the plants were cultivated under glutamine supplementation in two concentrations (0; 6.8 and 13.6 mM) in order to evaluate the effects of this amino acid in the growth and photosynthetic pigment accumulation of the plants. The major occurrence of tissue browning happened on the treatment without glutamine, characterized by leaves and root apexes with brown colour. Only the parameters of longest leaf and shoot apical height were positively affected by glutamine, without any difference between the treatments of 6.8 and 13.6 mM. Plants cultivated in the absence of glutamine had the lowest accumulation of chlorophyll a, carotenoids and xanthophyll. In the roots, it was observed further development of the protoxylem poles in the vascular cylinder and higher accumulation of starch in the plants cultivated under glutamine supply. The beneficial effects of glutamine on the in vitro morphogenesis are expected due to possible abbreviation of the nitrogen uptake route in the plant tissues, besides being an essential biomolecule to the synthesis of several other compounds, enzymes and strutural molecules such as chlorophylls. E. paranaënsis is a humiculous plant that inhabits the leaf litter layer, and thus has access to organic compounds from the degradation of leaves, and it is likely adapted to grow in conditions of broad organic nitrogen supply. Chapter II regards the photosynthetic state analysis of E. paranaënsis. In combination with the evaluation of the growth, the plants were submitted to a gas analyser and chlorophyll fluorescence in two moments: 1) 60 days of in vitro cultivation under different glutamine concentrations and natural ventilation (NV); 2) six months of ex vitro cultivation in greenhouse. Glutamine influences positively the leaf length and root number; however, NV is detrimental to root formation, with several occurrences of growth interruption. Under NV, it was observed an elevation of F0 and reduction of Fv/Fm, which indicates damages to the photosystem II. The parameters of energy dispersal (NPQ and Y(NPQ)) were also reduced by NV. Ventilated flaks loose water quickly, rising the osmotic potential of culture media, which may induce osmotic stress and damage the photosynthetic apparatus. The data also point to a failure in the energy dispersal route, possibly related to an insufficient carotenoid production. These results suggest that E. paranaënsis is sensitive to low environmental humidity and, therefore, the usage of sealed flasks is recommended for its in vitro culture. The acclimatization analysis showed high physiological plasticity from E. paranaënsis, as every parameter became identical amongst the plants, regardless of the treatment to which they were previously submitted. Transpiration and stomatal conductance of all plants were equal to zero, indicating that stomata remained closed during analysis period. Therefore, it can be concluded that E. paranaënsis probably performs CAM photosynthesis, as novel studies should be carried to investigate the photosynthetic behaviour of the species. At the end, in the months of January and February (2025), several plants entered flowering, and capsules developed correctly. In this sense, this work also described the life cycle of Eltroplectris paranaënsis, from seed germination to capsule maturation. The capacity for flowering and capsule production shows that plants of E. paranaënsis produced in vitro are physiologically functional and are suitable for reintroduction in nature, and may be used for the recovery of this rare species