Identificação de microRNAs associados a vesículas extracelulares como biomarcadores em biópsia líquida para o diagnóstico de câncer cervical e de lesões precursoras

Abstract

Resumo: O câncer cervical (CC) ocupa o quarto lugar entre os cânceres mais comumente diagnosticados em mulheres, sendo uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo. A carcinogênese cervical está intimamente associada aos papilomavírus humanos de alto risco (HPV-AR), considerados os agentes causadores de virtualmente todos os casos de CC. A infecção persistente por um HPV-AR induz uma importante mudança na expressão gênica global nas células hospedeiras contribuindo para a ocorrência do ciclo viral e, consequentemente, a manutenção da infecção. Mais recentemente, diversas evidências demonstraram a participação de vários microRNAs (miRNAs) na carcinogênese cervical, incluindo miRNAs associados a vesículas extracelulares (miRNAs-VE). Embora alguns biomarcadores moleculares tenham sido descritos como apresentando potencial diagnóstico e prognóstico no CC, o uso de miRNAs-VE como potenciais biomarcadores nesse contexto ainda está em seu início. Assim, é com base na necessidade imediata de se identificar e validar novos biomarcadores em biópsia líquida para o diagnóstico de CC e de lesões precursoras que este estudo foi proposto. Inicialmente, análise de bioinformática e busca na literatura foram conduzidas a fim de se selecionar potenciais miRNAs-VE candidatos para a identificação dos diferentes estágios de lesões precursoras/CC. Quatro candidatos foram selecionados – miR- 10b-5p, miR-148a-3p, miR-181b-5p e miR-155-5p – sendo os três primeiros quantificados em VEs isoladas a partir de amostras de plasma obtidas de controles e pacientes brasileiras com diferentes estágios de lesões cervicais. VEs plasmáticas foram isoladas por um método baseado em precipitação e, então, caracterizadas pela análise de rastreamento de nanopartículas, microscopia eletrônica de transmissão e western blotting. Os pellets isolados mostraram-se enriquecidos em exossomos. Os níveis de miR-VE-10b-5p foram significativamente menores em pacientes com CC do que em participantes sem lesão cervical (SL) (p<0,050; fold-change SL X CC = 1,883). A análise de curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic) revelou que o miR-VE-10b-5p apresenta potencial diagnóstico razoável em discriminar tais estágios, com sensibilidade e especificidade de 81,25% e 72,73%, respectivamente. Os níveis de miR-VE-181b-5p não variaram significativamente entre os grupos avaliados, enquanto os níveis de miR-VE-148a-3p foram significativamente menores em pacientes com lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LIEBG) em comparação às mulheres SL (p<0,050; fold -change SL X LIEBG = 3,437), bem como em comparação ao conjunto das pacientes com lesão intraepitelial escamosa de alto grau (LIEAG) e com CC (p<0,050; fold-change (LIEAG+CC) X LIEBG = 3,006). No entanto, seu potencial diagnóstico em discriminar os diferentes estágios não foi satisfatório. A validação em conjuntos amostrais adicionais, utilizando número amostral maior e incluindo diferentes populações faz-se necessária a fim de se confirmar e melhor entender o potencial dos miRNAs-VE avaliados como biomarcadores de diferentes estágios da carcinogênese cervical, especialmente do miR-VE-10b-5p. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo quantificando miRNAs-VE plasmáticos em diferentes estágios de CC e lesões precursoras em amostra populacional brasileira.

Abstract: Cervical cancer (CC) ranks fourth among the most commonly diagnosed cancers in women and is one of the leading causes of death by cancer worldwide. Cervical carcinogenesis is intimately associated with high-risk human papillomaviruses (HR-HPV), considered the causative agents of virtually all cases of CC. Following a persistent infection by an HR-HPV, an important change in global gene expression in host cells takes place, contributing to the maintenance of the viral cycle and, therefore, of the infection. Most recently, accumulating evidence has shown several microRNAs (miRNAs) taking part in cervical carcinogenesis, including extracellular vesicleassociated miRNAs (EV-miRNAs). Although some molecular biomarkers have been described as presenting diagnostic and prognostic potential in CC, the use of EVmiRNAs as potential biomarkers in such context is still starting to be set. This study was therefore proposed based on the urgent need to identify and validate new biomarkers in liquid biopsy for the diagnosis of CC and its precursor lesions. At first, bioinformatics analysis and literature search were applied to select potential candidate EV-miRNAs for identifying different stages of precursor lesions/CC. Four candidates were selected – miR-10b-5p, miR-148a-3p, miR-181b-5p, and miR-155-5p – and the first three were quantified in EVs isolated from plasma samples obtained from Brazilian controls and patients with different stages of cervical lesions. Plasma EVs were isolated through a precipitation-based method and were characterized by nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy, and western blotting. The isolated pellets presented an exosome-enriched pattern. EV-miR-10b-5p levels were significantly lower in CC patients than in subjects without cervical lesion (WL) (p<0.050; fold-change WL X CC = 1.883). Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis revealed EV-miR-10b-5p as presenting a fair diagnostic potential in discriminating such stages, with sensitivity and specificity of 81.25% and 72.73%, respectively. EV-miR- 181b-5p levels did not vary significantly between the evaluated groups, while EV-miR- 148a-3p levels were significantly lower in low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) patients in comparison to women WL (p<0.050; fold-change WL X LSIL = 3.437), as well as in comparison to high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) patients together with CC subjects (p<0.050; fold-change (HSIL+CC) X LSIL = 3.006). However, its diagnostic potential in discriminating the different stages was not satisfactory. Further validation sets using larger sample sizes and different populations are required to confirm and better understand the potential of the evaluated EV-miRNAs as biomarkers of the different stages of cervical carcinogenesis, especially of EV-miR- 10b-5p. To the best of our knowledge, this is the first study quantifying plasma EVmiRNAs in different stages of CC and its precursor lesions in the Brazilian population.