Conduzindo o estudo de KIR para a nova geração : caracterização em alta resolução de todos os genes KIR e ligantes HLA em populações sul-americanas

Abstract

Resumo: Os genes dos receptores semelhantes a imunoglobulina das células natural killer (KIR) codificam proteínas transmembrana que medeiam a função efetora das células NK (do inglês, natural killer) contra células próprias infectadas e neoplásicas, através da interação com antígenos leucocitários humanos (HLA, do inglês human leukocyte antigen) de classe I. Combinações de genes KIR e HLA já foram associadas a susceptibilidade diferencial a doenças autoimunes, infecciosas, câncer e também com o sucesso reprodutivo. O polimorfismo dos genes KIR é complexo e incomum, uma vez que determinados genes podem ou não estar presentes no cromossomo. A família KIR contém até 13 genes e 2 pseudogenes localizados no cromossomo 19q13.4, que, por sua vez, possuem grande diversidade alélica. A complexidade do estudo de KIR se amplifica pela homologia e alta similaridade de sequência entre os diversos genes. Como consequência, poucos são os estudos que caracterizaram a diversidade alélica de KIR, especialmente em populações. Portanto, o objetivo desse trabalho foi utilizar um método pioneiro e inovador através de sequenciamento de nova geração (NGS) para caracterizar, em alta resolução, a diversidade alélica de todos os loci KIR e dos loci de seus ligantes HLA em oito populações sul-americanas (uma eurodescente, uma descendente de japoneses, e seis ameríndias dos grupos Guarani, Kaingang e Aché; n=707). Além disso, buscamos evidências de coevolução envolvendo o receptor KIR2DL1, que reconhece com alta afinidade moléculas HLA-C do grupo C2. O NGS foi realizado no aparelho HiSeq 4000 após o enriquecimento das bibliotecas a partir de um conjunto de mais de 20 mil sondas biotiniladas específicas para aos genes KIR e HLA. A filtragem, alinhamento e identificação de genótipos de sequências KIR foi feita através do algoritmo PING; e o mesmo foi feito para os genes HLA, que foram analisados utilizando o programa HLA ExploreTM. Para a análise de coevolução, variantes em KIR2DL1 foram relacionadas aos níveis de expressão in silico de HLA C a partir de dados públicos do 1000 genomes e relacionada à expressão de KIR2DL1 em uma amostra de Curitiba, Paraná (n=48). Para a análise de expressão, foi coletado sangue periférico de indivíduos eurodescendentes que não relataram nenhuma doença aguda ou crônica, seguido da separação de linfócitos mononucleados (PBMC) e extração de DNA. A genotipagem alélica de KIR2DL1 foi feita através de sequenciamento Sanger e os níveis de expressão foram avaliados por citometria de fluxo. Foram encontradas nas populações desse estudo 209 variantes nos 13 genes KIR, organizadas em 37 haplótipos centroméricos e 44 haplótipos teloméricos. Os ameríndios apresentaram menor número de alelos, cerca de 58 por população, e menor diversidade de haplótipos, com até 9 haplótipos centroméricos e 12 haplótipos teloméricos. A diversidade de KIR mantida em ameríndios pode ser considerada a mínima já observada em populações humanas, e esta é principalmente concentrada nas interações com HLA-C (até 97,2%). Ainda, nós encontramos evidência de coevolução entre KIR e HLA ao observar uma variante em KIR2DL1, rs2304224T, que marca os níveis de expressão de KIR2DL1 (p = 0,0002) e HLA-C2 (p < 0,05). Esta variante está em desequilíbrio de ligação com outras duas variantes, rs4806553G e rs687000G, que apresentam elevada homozigose compatível com seleção positiva. Os resultados desse estudo têm o potencial de contribuir para a compreensão da variação normal dos genes KIR e na compreensão das relações evolutivas entre as famílias gênicas KIR e HLA, bem como suas implicações na susceptibilidade diferencial a doenças.

Abstract: Killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes encode surface transmembrane molecules that mediate NK (natural killer) cell function against neoplastic and infected cells. KIR interact with human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on the surface of target cells. Combinations of KIR and HLA alleles have been associated with susceptibility to autoimmune diseases, viral infections, cancer and reproductive success. The KIR family comprises up to 13 genes and 2 pseudogenes located on chromosome 19q13.4 that exhibit an unusual and complex presence and absence polymorphism. In addition, each single locus exhibits extensive allelic diversity, which is difficult to analyze due to several technical difficulties imposed by high sequence similarity among KIR genes. Consequently, studies that characterize KIR alleles are scarce, especially among populations. Thus, the aim of this project is to use a pioneer and cutting-edge next generation sequencing (NGS) method to characterize, in high resolution, the allelic diversity of all KIR genes and HLA ligands in eight South American populations (European and Japanese descendants from Curitiba, and six Amerindian populations belonging to the Guarani, Kaingang and Aché groups, n=707). Besides describing the allelic and haplotype frequencies, we aim to search for evidences of coevolution involving KIR2DL1, which is the stronger receptor for C2 allotypes of HLA-C. NGS was performed in HiSeq 4000 after library enrichment with over 20,000 biotinylated probes to capture the KIR and HLA regions. Sequence filtering, alignment and genotype calling of KIR genes were performed using PING pipeline; for HLA genes sequence reads were analyzed using the software HLA ExploreTM. For coevolution analysis, we searched for KIR2DL1 variants which could influence HLA-C expression levels in silico using public data from 1000 genomes, and verified if those also marked KIR2DL1 expression levels in a group of Euro descendants from Curitiba (n=48). In order to assess KIR2DL1 expression levels, we collected peripheral blood from euro-descendant individuals from Curitiba with no report of acute or chronic disease, followed by mononuclear cells (PBMC) isolation and DNA extraction. KIR2DL1 was sequenced using Sanger method and expression levels were measured through flow cytometry. In the 13 KIR loci analyzed, we found 209 variants organized in 13 centromeric and 44 telomeric haplotypes. Amerindians present reduced KIR diversity, averaging 58 KIR alleles per population, and a reduced diversity of haplotypes, with a maximum of 9 centromeric and 12 telomeric haplotypes. This reduced diversity in KIR maintains mainly HLA-C interactions (up to 97.2%). We also present evidence of coevolution between HLA-C and KIR2DL1 by showing that a KIR2DL1 variant, rs2304224T, marks KIR2DL1 expression (p = 0.002) and HLA-C expression (p < 0.05). This variant is in linkage disequilibrium with other two KIR2DL1 variants, rs4806553G and rs687000G, which present elevated homozygosity compatible with positive selection. The results of this study may provide the basis for the comprehension of KIR diversity and susceptibility to diseases, as well as insights on KIR-HLA coevolution.