Associação entre resíduos de aminoácidos em posições relevantes da fenda de moléculas HLA-B e HLA-DR com neoplasia intraepitelial cervical

Abstract

Resumo: O carcinoma do colo do útero (CCU) é um dos principais responsáveis pela mortalidade feminina mundial. Diferentemente da maioria dos cânceres, o CCU apresenta estádios precursores que podem levar anos até a progressão para um carcinoma invasivo. Estas lesões denominam-se neoplasias intraepiteliais cervicais (NICs) e são classificadas como de baixo (NIC I) ou de alto grau (NIC II e III). A infecção pelo HPV é um fator necessário, mas não suficiente para o desenvolvimento de NICs e CCU. Fatores ambientais e genéticos também podem influenciar no desenvolvimento e progressão da doença. As moléculas HLA são responsáveis pela apresentação de antígenos aos linfócitos T, que tem um papel fundamental na resposta imunológica frente ao HPV. As moléculas HLA clássicas são codificadas pelos genes HLA, como HLA-B e HLA-DRB1. Alelos destes genes já foram previamente associados com infecções virais e câncer, dentre eles o CCU. Resíduos de aminoácidos presentes nas moléculas HLA também já foram associados ao CCU, em especial os da posição 156 da cadeia polipeptídica de HLA-B e 13 e 71 do pocket 4 de HLA-DRB1, presentes na fenda de ligação aos peptídeos. O objetivo deste trabalho é investigar se há associação entre alelos dos genes HLA-B e HLA– DRB1, assim como os resíduos de aminoácidos presentes nas posições 156 da cadeia polipeptídica de HLA–B e 13 e 71 do pocket 4 de HLA-DRB1 com neoplasia intraepitelial cervical, na população de Curitiba e região metropolitana. Dados sócio comportamentais foram obtidos através de questionários epidemiológicos e amostras de sangue e raspado cervical foram coletadas de mulheres com citologia normal, NIC II e NIC III. O DNA do sangue periférico foi utilizado na genotipagem de HLA-B e HLA-DRB1, realizada por PCR-SSOP. O resultado foi interpretado com auxílio do programa HLA Fusion, bem como a determinação dos resíduos de aminoácidos encontrados nas posições de interesse. Os testes do qui-quadrado e exato de Fisher bicaudal foram utilizados nas análises univariadas. As análises multivariadas foram feitas por regressão logística. Quando aplicável, foi calculado o odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os alelos HLA-B*39 e HLA-DRB1*13:01 e foram associados negativamente a NIC II/III (p = 0,04; OR = 0,37 [IC 95% = 0,14-0,97]; p = 0,02; OR = 0,43 [IC 95% = 0,21-0,90]); respectivamente). A associação com o alelo HLA-DRB1*’13:01 se manteve após a regressão logística (p = 0,006; OR = 0,32; [IC 95% = 0,14-0,72]), mas o mesmo não ocorreu com HLA-B*39 (p = 0,21; OR = 0,47; [IC 95% = 0,15-1,52]). Foi observada uma associação entre o genótipo histidina/tirosina, na posição 13 de HLA-DRB1, e NIC II/III (p = 0,03; OR = 3,97 [IC 95% = 1,1-14,37]) e tendência semelhante foi verificada na regressão logística (p = 0,05; OR = 2,86 [IC95% = 0,99-15,01]). O aminoácido serina, presente na mesma posição, foi associado negativamente com NIC II/III na análise univariada (p = 0,02; OR = 0,58 [IC 95% = 0,37=0,92], contudo a associação não foi mantida após a regressão (p = 0,28; OR = 0,71 [IC 95% = 0,38-1,32]). Nossos resultados sugerem que o polimorfismo dos genes HLA-B e HLA-DRB1 influencia a suscetibilidade às lesões cervicais causadas pelo HPV.

Abstract: Cervical cancer (CC) is one of the main causes of women mortality worldwide. Differently from other types of cancer, CC presents precancerous lesions stages, which can take years until the progression to invasive cancer, called cervical intraepithelial neoplasia (CIN). It can be classified as low-grade (CIN I) and high grade (CIN II/III). Although HPV infection is a necessary cause for NIC and CC development, it is not enough. Environmental and genetic factors play an important role in disease development and progression. Classics HLA molecules are responsible for antigen presentation to T cells, which play a fundamental role in the immune response against HPV and CC. HLA molecules are coding by HLA genes, such as HLA-B and HLA-DRB1. Alleles from these genes have been previously associated with viral infections and cancer, included CC. Amino-acids residues at HLA molecules have also been associated with CC, especially the ones carried at position 156 in HLA-B and positions 13 and 71 in pocket 4 of HLA-DRB1. We aimed to investigate if there are HLA-B and HLA– DRB1 polymorphism association with CIN II/III, as well as the amino-acids residues at position 156 in HLA-B and positions 13 and 71 in pocket 4 of HLADRB1, in a population from Curitiba-Brazil. Sociodemographic and behavioural characteristics were obtained by questionnaire. Cervical and blood samples were collected from women with normal cytology, CIN II and CIN III. DNA from blood samples were submitted to HLA typing, by PCR-SSOP. HLA Fusion interpreted the results from PCR-SSOP, as well as the amino-acids residues determination. Univariate statistical analyses were carried out using Chi-square and Fisher’s Exact tests. Multivariate analyses were carried out using logistic regression. When it was applicable, the odds ratio (OR) with its respective 95% confidence interval (CI 95%) was calculated. P values < 0.05 were considered statistic significant. The Alleles HLA-B*39 and HLA-DRB1*13:01 were negatively associated with CIN II/III (p = 0.04; OR = 0.37 [CI 95% = 0.14-0.97]; p = 0.02, OR = 0.43 [CI 95% = 0.21-0.90]). The HLA-DRB1*13:01 association persisted after logistic regression (p = 0.006, OR = 0.32 [CI 95% = 0.14-0.72]), but not with HLAB* 39 (p = 0.21, OR = 0.47, [IC95% = 0.15-1.52]). The amino-acid combination histidine/tyrosine, carried at position 13 in pocket 4 of HLA-DRB1, was associated with NIC II/III susceptibility (p = 0.03, OR = 3.97 [CI 95% = 1.1-14.37]). In logistic regression analyses, we found a tendency to association (p = 0.05, OR = 2.86 [CI 95% = 0.99-15.01]). Additionally, the serine amino-acid residue, carried at the same position, was associated with NIC II/III protection (p = 0.02, OR = 0.58 [CI 95% = 0.37-0.92]. However, it was not kept after logistic regression (p = 0.28, OR = 0.71 [CI 95% = 0.38-1.32]). Our outcomes suggest that polymorphism in HLAB and HLA-DRB1 genes make an important influence in genetic susceptibility to CIN, caused by HPV.