PCR digital para identificar mutações somáticas em pacientes com câncer colorretal e câncer de pulmão

Abstract

Resumo: O rastreio de mutações no gene que codifica o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) é essencial para direcionamento terapêutico no carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC, do inglês non-small-cell lung cancer), enquanto que mutações no gene KRAS (do inglês, Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog) devem ser investigadas no câncer colorretal (CCR). A PCR digital (dPCR) é proposta como substituição ao sequenciamento de Sanger ou à PCR em tempo real, para detecção e quantificação de mutações raras. Com o intuito de validar a técnica de dPCR para este fim, realizamos a extração de DNA de 57 biópsias de NSCLC, 41 biópsias de CCR e 10 biópsias livres de neoplasia de pacientes brasileiros, todas fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE). Investigamos as mutações DEL19, p.L858R, p.T790M, p.L861Q, p.S768I e p.G719X nos exons 18-21 no gene EGFR e mutações no códon 12 e p.G13D no exon 2 no gene KRAS utilizando dPCR, sequenciamento de Sanger e PCR competitiva alelo-específica por TaqMan® (castPCR), e determinamos a sensibilidade e os limites de detecção (LoD) e quantificação (LoQ) da técnica de dPCR. Foram encontradas 27 amostras de câncer de pulmão com mutações somáticas no gene EGFR por dPCR, comparado a 11 por castPCR (p=0.014) e 4 por sequenciamento (p=0.0002). Além disso, foram encontradas 28 amostras portadoras de mutações somáticas no gene KRAS por dPCR, 8 destas com mutações no códon 13, em comparação a 13 amostras com mutações somáticas em KRAS, por sequenciamento de Sanger (p=0.04). Não houve diferença entre as técnicas de dPCR e castPCR para a quantificação de mutações no gene KRAS (p>0.05). LoD foi de 100 moléculas de DNA/mL, enquanto que a LoQ, 1%. Grande parte das amostras (86,96%) identificadas como portadoras do alelo mutante por dPCR, e que não tiveram tal alelo detectado por castPCR, apresentaram menos de 10% de moléculas mutadas (média 4,57%). Não foram observadas mutações nas amostras livres de neoplasia. A acurácia da técnica de dPCR foi de 94,44% para detecção de EGFR e 85,71% para detecção de KRAS, de acordo com o Colégio Americano de Patologia (CAP). Estes resultados indicam maior sensibilidade da técnica de dPCR para a investigação de mutações nos genes EGFR e KRAS em biópsias de NSCLC e CCR, comparado ao sequenciamento de Sanger e à castPCR. Palavras-chave: EGFR; câncer de pulmão; KRAS; câncer colorretal; PCR digital.

Abstract: Screening of endothelial growth factor receptor (EGFR) mutations is mandatory in non-small-cell lung cancer (NSCLC), whereas KRAS (Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog) mutations shall be investigated in colorectal cancer (CRC). Digital PCR (dPCR) is proposed to replace Sanger sequencing or real-time PCR for detection and quantification of rare mutations. In order to validate dPCR to detect EGFR somatic mutations in NSCLC and KRAS somatic mutations in CRC, we extracted DNA from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples of 57 NSCLC, 41 CRC and 10 free-cancer Brazilian patients. We are looking for EGFR mutations in exons 18-21 and exon 2 KRAS mutations using dPCR, Sanger Sequencing and Competitive Allele-Specific PCR (castPCR), and determine dPCR sensitivity, limits of detection (LoD) and quantification (LoQ). We found 27 samples with EGFR mutations by dPCR, versus 11 by castPCR (p=0.014) and 4 by Sanger Sequencing (p=0.0002). We also found 28 samples with KRAS somatic mutations by dPCR, 8 of which had mutations in codon 13, comparing to 13 by Sanger Sequencing (p=0.04). We found no difference between quantification of KRAS mutations by dPCR and castPCR (p>0.05). LoD was 100 molecules of DNA/mL and LoQ, 1%. Most of the samples (86.96%) identified by castPCR as wild-type and by dPCR as mutated, presented less than 10% mutated DNA molecules (mean 4.57%). We found no mutations in free-cancer samples. Accuracy was 94.44% for EGFR detection and 85.71% for KRAS detection, as measured with the assay recommended by the College of American Pathologist. These results indicated higher sensitivity and specificity of dPCR for screening EGFR and KRAS mutations in NSCLC and CRC biopsies, compared with Sanger Sequencing and castPCR. Keywords: EGFR; lung cancer; KRAS; colorectal cancer; digital PCR.