A diversidade genética de HLA-G, MICA e NKG2D no transplante renal

Abstract

Resumo: Numa população tão heterogênea como a brasileira, o estudo de genes pouco explorados, como o HLA (human leukocyte antigen)-G e MICA (MHC class Ipolypeptide-related gene A), e de grande relevância para a compreensão de aspectos evolutivos e imunológicos. Estes genes codificam moléculas de mesmo nome, que em contextos patológicos, atuam na imunorregulação, podendo ser via isoformas solúveis (sHLA-G e sMICA) ou expressas ligadas a membrana celular. HLA-G interage com receptores inibidores de linfócitos e MICA de membrana interage com NKG2D, ativando células NK (natural killers). Neste trabalho foi realizada a caracterização de polimorfismos presentes nos genes MICA, NKG2D e HLA-G por meio, respectivamente, de PCRSSOP, qPCR e SBT em população controle, sem doença renal crônica (Ct, n = 79), pacientes com doença renal crônica (DRC, n = 99) e pacientes submetidos a transplante renal (Tx, n = 67). Aliada a esta genotipagem, foi avaliada a associação de alelos, haplótipos e genótipos com a expressão das moléculas MICA e HLA-G nas suas formas solúveis detectadas no plasma por meio de ELISA. Também foi conduzida analise de associação com o risco de desenvolvimento de DRC e a rejeição no Tx. Com isso, ficou evidente que a produção de sHLA-G e sMICA e estimulada mediante a um estresse continuo, como a DRC. Porem a produção sMICA no pre-Tx tem um importante papel na imunorregulação e estabelecimento do aloenxerto. O polimorfismo +3010 (rs1710) se sobressaiu frente as outras variações analisadas, sendo relacionado ao risco de rejeição. Em estudo paralelo, também foram avaliadas mais de vinte variáveis de doadores e receptores coletadas na fase do pré- Tx. Via analise univariada e multivariada de dados, estas variáveis foram criteriosamente selecionadas com relação ao poder em discriminar pacientes que tenham desenvolvido episódios de rejeição ou não. O modelo final de seleção apresentou 70,7% de poder de predição, aferindo como sendo os principais fatores de risco o sexo masculino, as incompatibilidades HLA-B e ao tempo de dialise. Ainda, em modelo celular foi investigado o potencial de HLA-G mediar a imunotolerância em células endoteliais (CEs, linhagens HMEC-1 e HRGEC), as quais, no entanto, são consideradas o principal alvo dos mecanismos de rejeição em transplantes de órgãos sólidos. As linhagens de CEs foram tipadas para o gene HLA-G, analisadas quanto a expressão de LILRB1, LILRB2, HLA-G de membrana e intracelular (mHLA-G e iHLA-G) via citometria de fluxo, e avaliadas quanto a produção de transcritos de HLA-G via qPCR. Foram observadas pequenas subpopulações de CEs LILRB2+. Apesar das linhagens celulares estudadas apresentarem genótipos capazes de originar moléculas HLA-G funcionais, foi detectado apenas iHLA-G. Este fato foi associado a confluência celular e a qualidade do meio de cultura, os quais foram determinantes para a expressão de HLA-G. Esta regulação fina, na expressão do gene HLA-G e no papel da sMICA, demonstra ainda existir um grande potencial a ser explorado para se alcançar a tolerância natural. Palavras-chave: HLA-G. MICA. Transplante renal. Tolerância.

Abstract: In a heterogeneous population as the Brazilian one, the study of poorly explored genes, such as HLA (human leukocyte antigen)-G and MICA (MHC class I polypeptide-related gene A), is of great relevance for the understanding of evolutionary and immunological aspects. These genes encode molecules of the same name, which in pathological contexts, act on immunoregulation. This can occur via soluble isoforms (sHLA-G and sMICA) or expressed bound to the cell membrane. HLA-G interacts with lymphocytes inhibitory receptors and MICA of membrane interacts with NKG2D in NK (natural killers) cells, during activation of the immune response. Therefore, this study consisted on investigation of polymorphisms present in MICA, NKG2D (MICA receptor encoding gene) and HLA-G genes through, respectively, PCR-SSOP, qPCR and SBT. This was performed in a control population, without chronic kidney disease (Ct, n = 79), patients with chronic kidney disease (CKD, n = 99) and patients undergoing kidney transplant (Tx, n = 67). In addition to this genotyping, the association of alleles, haplotypes and genotypes with the expression of MICA and HLA-G molecules in their soluble forms detected in plasma by ELISA was evaluated. Also, the genetic and phenotypic association analyses were performed with the risk of developing CKD and Tx rejection. Thus, it was shown that the production of sHLA-G and sMICA is stimulated by continuous stress, such as CKD. However, sMICA production in pre-Tx plays an important role in immunoregulation and establishment of allograft. The polymorphism +3010 (rs1710) stood out against the other variations and haplotypes, being related to the risk of rejection. Still, in a separate study, more than twenty variables from donors and recipients were collected in the kidney pre-Tx period. These were carefully selected with respect to the discriminatory power of immune rejection, via univariate and multivariate data analyses. The final selection model presented a 70.7% of predictive power, with the male sex, HLA-B incompatibilities and dialysis time being the main risk factors. In addition, in a cellular model was investigated the potential of HLA-G mediate immunotolerance in endothelial cells (CEs, HMEC- 1 and HRGEC), which, however, are considered the main target of rejection mechanisms in solid organ transplants. The ECs lineages were typed for HLA-G gene, analyzed for expression of LILRB1, LILRB2, membrane and intracellular HLA-G (mHLA-G and iHLA-G) expression by flow cytometry and evaluated for the production of HLA-G transcripts via qPCR. Small subpopulations of LILRB2+ ECs were observed. Although the cell lines studied had genotypes capable of generating functional HLA-G molecules, only iHLA-G was detected. This fact was associated with cell confluence and the quality of the culture medium, that were determinants for expression of HLA-G. This fine regulation, in the expression of the HLA-G gene and in the role of sMICA, still demonstrates a great potential to be explored in order to achieve natural tolerance. Key-words: HLA-G. MICA. Kidney transplantation. Tolerance.