Análise funcional do RNA longo CARDEL no contexto da diferenciação cardíaca in vitro : acesso do potencial codificante e da interação com proteínas ligantes de RNA

Abstract

Resumo: Além de uma complexa rede de fatores de transcrição, o processo de diferenciação cardiomiogênica em vertebrados envolve também mecanismos de regulação mediados por proteínas ligantes de RNA (RBPs) e RNAs não codificantes (ncRNAs). Dentre os ncRNAs, os microRNAs e os RNAs longos (lncRNAs) desempenham funções importantes na cardiomiogênese, atuando na regulação de mRNAs. Os miRNAs geralmente inibem mRNAs, enquanto lncRNAs podem regular mRNAs de maneira direta ou mediada por RBPs. Em um estudo de expressão gênica de diferentes estágios de diferenciação cardíaca in vitro, um lncRNA específico denominado CARDEL (CARdiac DEvelopment LncRNA) despertou interesse por apresentar expressão aumentada em células progenitoras cardíacas e estar associado aos polissomos. Duas hipóteses foram levantadas sobre os motivos desta associação e foram testadas ao longo do trabalho. Uma primeira hipótese considerou que CARDEL pode ter potencial codificante para pequenos peptídeos, como já descrito para outros lncRNAs. Bases de dados recentemente anotaram o CARDEL como codificante para o peptídeo SERTM2, a partir de um de seus pequenos quadros abertos de leitura (sORF-1). A avaliação do potencial de tradução do sORF-1 de CARDEL em células humanas envolveu a construção de um plasmídeo pcDNA 3.1 contendo o sORF-1 fusionado à sequência codificante (CDS) de enhanced GFP (eGFP), via clonagem com as endonucleases BamHI/EcoRI. A microscopia de fluorescência de HEK293 transfectadas com a construção resultante pcDNA 3.1-CARDEL1A-eGFP permitiu observar um sinal correspondente a eGFP. O Western Blot dos extratos indicou a presença do peptídeo SERTM2-eGFP, reforçando o potencial codificante de CARDEL. Para caracterizar o possível papel de SERTM2 na função do CARDEL durante a cardiomiogênese, uma nova linhagem de células-tronco pluripotentes PLZ foi gerada e usada na superexpressão induzida do CARDEL com uma mutação em seus sORFs (CARDEL mut). Células PLZ foram transfectadas com o vetor integrativo AAVS1-CARDEL mut e selecionadas por puromicina. Um dos clones PLZ CARDEL mut (C8.1) apresentou sistema de indução funcional, expressão de marcadores de pluripotência NANOG e OCT4A e cariótipo adequado, sendo escolhido para experimentos de diferenciação cardíaca já iniciados. A segunda hipótese do presente trabalho foi de que o CARDEL atua na regulação pós-transcricional de mRNAs durante a cardiomiogênese ao interagir com RBPs. Esse potencial foi explorado in silico por meio da anotação de sítios de ligação de RBPs no CARDEL e da estimativa da probabilidade de interação. Três proteínas candidatas foram selecionadas: LN28A, YBOX1 e RBFOX1. Interações CARDEL-RBPs também foram analisadas pela técnica de incPRINT, que consistiu na superexpressão conjunta de RBPs e do cDNA de CARDEL e estimou sua força de interação por unidades relativas de luminescência (RLU). Testes preliminares de interação do CARDEL com RBPs comuns resultaram em RLUs abaixo do limite mínimo requerido. Como a maioria das proteínas testadas interage com sequências intrônicas ou 5’/3’ – UTR, ausentes no cDNA de CARDEL, a inclusão dessas sequências pode viabilizar o uso do incPRINT. Apesar da natureza da associação do CARDEL a polissomos não ter sido definitivamente elucidada, o presente trabalho conseguiu fortalecer hipóteses e desenvolver ferramentas para estudos mais aprofundados sobre o papel desse transcrito na cardiomiogênese

Abstract: In addition to a complex network of transcription factors, the process of cardiomyogenic differentiation in vertebrates also entails regulatory mechanisms mediated by RNA-binding proteins (RBPs) and non-coding RNAs (ncRNAs). Among ncRNAs, microRNAs and long non-coding RNAs (lncRNAs) perform important functions in cardiomyogenesis, such as regulation of mRNAs. MiRNAs generally inhibit mRNAs, while lncRNAs might regulate mRNA directly or siding with RBPs. In a study of gene expression of different stages of cardiac differentiation in vitro, a specific lncRNA named CARDEL (CARdiac DEvelopment LncRNA) came to light, as it showed an increased expression in cardiac progenitors and was associated with polysomes. Two hypotheses were raised about these associations and were tested through this study. The first hypothesis considered that CARDEL has a coding potential to small peptides, as described to other lncRNAs. Recently, CARDEL was annotated as protein coding for the SERTM2 peptide, transcribed from one of its small open reading frames (sORF-1). Evaluation of CARDEL sORF-1 coding potential in human cells required the construction of a pcDNA 3.1 vector comprising a sORF-1 fused to enhanced GFP (eGFP) coding sequence (CDS), using BamHI/EcoRI endonucleases. Fluorescent microscopy of HEK293 cells transfected with pcDNA 3.1-CARDEL1A-eGFP plasmid enabled eGFP signal detection. Western Blot analysis of cell extracts pointed to SERTM2-eGFP peptide synthesis, strengthening the coding potential hypothesis for CARDEL. Aiming to characterize a possible role of SERTM2 in CARDEL function during cardiomyogenesis, a novel stem-cell PLZ lineage was made and used to promote induced overexpression of CARDEL containing a frameshift mutation in its sORFs (CARDEL mut). PLZ cells were transfected with the integrative vector AAVS1-CARDEL mut and selected by puromycin treatment. One of the PLZ CARDEL mut clones (C8.1) presented a functional expression cassette, expressed NANOG and OCT4A pluripotency markers and a correct karyotype, being chosen for cardiac differentiation experiments that have just started. The second hypothesis of the current work was that CARDEL acts in mRNAs post-transcriptional regulation during cardiomyogenesis, interacting with RBPs. This potential was explored in silico through annotation of CARDEL’s RBP binding sites and calculation of its interaction probability. Seven candidate proteins were selected: LN28A, DAZP1, HNRPL, MSI1, RBFOX1, SMAG1/SMAUG1 and YBOX1. CARDEL-RBPs interactions were also analysed by incPRINT, a technique consisting in co-overexpression of RBPs and CARDEL cDNA that estimated CARDEL-RBPs interaction strength in relative luminescent units (RLU). Preliminary interaction tests between CARDEL and common binding RBPs resulted in RLUs below the required minimum threshold. As most of the tested proteins interact with intronic or 5’/3’ – UTR sequences lacking in CARDEL cDNA, the inclusion of these sequences could make the incPRINT technique viable. Although the mechanism underlying CARDEL post-transcriptional regulation remains elusive, the current work managed to strengthen hypotheses and to develop tools for more detailed studies about the role of this transcript to cardiomyogenesis