Padronização e detecção molecular de agentes infecciosos envolvidos no Complexo Respiratório Bovino no Estado do Paraná

Abstract

Resumo: O Complexo Respiratório Bovino (CRB) é uma enfermidade com alta prevalência entre bovinos de todas as idades, resultando em significativas perdas econômicas. É caracterizado pela interação de vários fatores, como condições ambientais, manejo, presença de agentes patogênicos e suscetibilidade individual. A transmissão ocorre por meio do contato direto ou por fômites. Os principais vírus envolvidos são coronavírus bovino (BCoV), vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), alfaherpesvírus bovino tipo 1 (BoAHV1) e vírus parainfluenza bovino tipo 3 (BPIV3). As bactérias mais encontradas são Mycoplasma bovis, Histophilus somni, Mannheimia haemolytica e Pasteurella multocida. Diante disso, este trabalho objetiva avaliar, adaptar, otimizar e multiplexar protocolos de reação em cadeia da polimerase em tempo-real (qPCR) para detecção rápida dos principais agentes infecciosos envolvidos no CRB, e relatar um surto de doença respiratória que ocorreu na Mesorregião do Centro Oriental Paranaense. Até o momento, não foram identificados outros estudos que proponham protocolos semelhantes aplicáveis a esses patógenos. Foram realizadas curvas padrões de eficiência com controles positivos utilizando o método OFAT (um fator de cada vez), considerando temperatura de anelamento, concentração de primers e de material genético. A avaliação da eficiência foi realizada por meio de regressão linear, considerando os valores do ciclo de quantificação. Ainda, foi estimado um cálculo do custo de processamento dos ensaios, indicando que utilizar singleplex custa mais que o dobro do que custaria uma multiplex. Ao realizar otimização dos reagentes, estima-se economia de 70% com os custos de insumos laboratoriais. E, é aproximadamente 80% mais caro utilizar kits comerciais, quando comparado com o método multiplex in house proposto por este estudo. Paralelamente, foram coletadas amostras clínicas de animais provenientes de propriedades com surto de doença respiratória a fim de testar os protocolos adaptados. Foi detectado pelo menos algum agente etiológico patogênico em 57,62% das amostras coletadas a campo (121/210). Nas positivas, 71,9% (87/121) apresentaram apenas um agente, e 28,1% (34/121) com a detecção simultânea de dois ou mais agentes, o que confirma a possibilidade de coinfecções no Complexo Respiratório Bovino. Um dos surtos ocorreu em Sengés/PR (24°06'46"S 49°27'50"O), onde foi detectado BRSV (17/20) associado com P. multocida (16/20) e H. somni (10/20) em amostras de swab nasal e oral de animais não vacinados provenientes de uma propriedade leiteira. Por fim, conclui-se que a implementação de um painel diagnóstico pode proporcionar melhorias quanto à detecção, manejo e prevenção do CRB. É necessário monitorar os agentes etiológicos envolvidos para reduzir perdas econômicas e aumentar a sanidade e a produção

Abstract: Bovine Respiratory Disease Complex (BRD) is a highly prevalent disease among cattle of all ages, resulting in significant economic losses. It is characterized by the interaction of various factors, such as environmental conditions, management practices, presence of pathogenic agents, and individual susceptibility. Transmission occurs through direct contact or via fomites. The main viruses involved are bovine coronavirus (BCoV), bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine alphaherpesvirus type 1 (BoAHV1), and bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3). The most commonly found bacteria are Mycoplasma bovis, Histophilus somni, Mannheimia haemolytica, and Pasteurella multocida. This study aims to evaluate, adapt, optimize, and multiplex real-time polymerase chain reaction (qPCR) protocols for rapid detection of the main infectious agents involved in BRD, as well to report an outbreak of respiratory disease that occurred in the eastern central mesoregion of Paraná state, southern Brazil. No other studies have proposed similar protocols applicable to these pathogens. Efficiency standard curves were generated with positive controls using the one factor at a time (OFAT) method, considering annealing temperature, primer concentration, and genetic material concentration. Efficiency evaluation was conducted through linear regression, considering quantification cycle values. Additionally, a cost analysis of the assay processing indicated that using singleplex tests is more than twice as expensive as multiplex testing. Optimizing reagents was estimated to reduce laboratory supply costs by 70%. Moreover, commercial kits were found to be approximately 80% more expensive compared to the proposed in-house multiplex method. Simultaneously, clinical samples were collected from animals on farms experiencing outbreaks of respiratory disease to test the adapted protocols. At least one pathogenic agent was detected in 57.62% of the field-collected samples (121/210), with 71.9% (87/121) showing only one agent and 28.1% (34/121) with simultaneous detection of two or more agents, confirming the possibility of coinfections in the Bovine Respiratory Complex. One of the outbreaks occurred in Sengés/PR (24°06'46"S 49°27'50"O), where BRSV (17/20) was detected in association with P. multocida (16/20) and H. somni (10/20) in nasal and oral swab samples from non-vaccinated animals on a dairy farm. The implementation of a diagnostic panel can improve detection, management, and prevention of BRD. Monitoring the etiological agents involved is necessary to reduce economic losses and enhance health and production