Construção e caracterização de uma linhagem derivada de HeLa para análise de moduladores do fator de transcrição NRF2

Abstract

Resumo: O estresse oxidativo, resultado do desequilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio/nitrogênio (ROS/RNS) e os sistemas antioxidantes, pode levar a danos celulares e contribuir para diversas patogenias, como câncer e doença renal crônica. O fator de transcrição NRF2 é um regulador central da resposta antioxidante, ligando-se ao elemento de resposta antioxidante (ARE) nos genes-alvo e modulando suas expressões, contribuindo para a homeostase redox. A ativação canônica do NRF2 ocorre por modificações em resíduos de cisteínas na proteína Keap1. Esta e outras vias de ativação podem ser exploradas no tratamento de doenças e vem se mostrando eficaz em experimentos com animais e ensaios clínicos. Este trabalho teve como objetivo caracterizar uma linhagem estável derivada da linhagem HeLa (carcinoma de colo uterino humano) para ser usada em análise do gene repórter luciferase para o screening de compostos moduladores de NRF2 e em RT-qPCR para validação dos compostos candidatos. A linhagem foi produzida pela transfecção do vetor pGL4.22-ARE-mGST [luc2CP/Puro] com a sequência ARE do gene glutationa S-transferase de camundongo (mGST), seguida da seleção por puromicina. A linhagem foi denominada POLI e foi avaliada quanto a resposta à modulação de NRF2. Para isso, foram utilizados sulforafano (SFN) como ativador e trigonelina (TGN) como inibidor de NRF2. A expressão de NRF2 foi analisada por Western blotting, a expressão da luciferase foi analisada por imunofluorescência indireta e a atividade da luciferase foi avaliada por luminescência. Utilizamos também RT-qPCR para avaliar a expressão de genes alvo de NRF2. Os resultados mostraram que a linhagem estável POLI se mostrou bastante responsiva ao SFN e ao TGN em todos os ensaios realizados. Assim, a plataforma pode ser empregada para buscarmos novos moduladores de NRF2

Abstract: Oxidative stress, resulting from the imbalance between reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) and antioxidant systems, can lead to cellular damage and contribute to several pathogenesis, such as cancer and chronic kidney disease. The transcription factor NRF2 is a central regulator of the antioxidant response, binding to the antioxidant response element (ARE) in target genes and modulating their expression, contributing to redox homeostasis. Canonical NRF2 activation occurs by modifications in cysteine residues in the Keap1 protein. This and other activation pathways can be explored in the treatment of diseases and have been shown to be effective in animal experiments and clinical trials. This work aimed to characterize a stable cell line derived from the HeLa (human cervical carcinoma) lineage to be used in luciferase reporter gene analysis for the screening of NRF2-modulating compounds and in RT-qPCR for validation of candidate compounds. The strain was produced by transfection of the pGL4.22-ARE-mGST [luc2CP/Puro] vector with the ARE sequence of the mouse glutathione S-transferase (mGST) gene, followed by puromycin selection. The strain was named POLI and was evaluated for its response to NRF2 modulation. For this purpose, sulforaphane (SFN) was used as an activator and trigonelline (TGN) as an inhibitor of NRF2. NRF2 expression was analyzed by Western blotting, luciferase expression was analyzed by indirect immunofluorescence, and luciferase activity was evaluated by luminescence. We also used RT-qPCR to evaluate the expression of NRF2 target genes. The results showed that the stable strain POLI was highly responsive to SFN and TGN in all assays performed. Thus, the platform can be used to search for new NRF2 modulators