Estabelecimento de ferramentas para expressão recombinante de antígenos e anticorpos diméricos em células de mamíferos

Abstract

Resumo: O coronavírus SARS-CoV-2 é o agente etiológico da COVID-19, doença respiratória que se espalhou rapidamente pelo mundo a partir do final de 2019. Testes de detecção do genoma utilizando a técnica de RT-PCR são considerados os mais apropriados para detecção de infecções ativas, todavia esta técnica possui custo elevado, demanda laboratórios e profissionais especializados para sua implementação. Métodos de captura de antígenos têm auxiliado no rastreamento de infecções ativas e vacinas e fármacos vêm sendo eficientes para conter a pandemia. No entanto, o número de casos e óbitos ainda é alto e o surgimento contínuo de novas variantes requerem a manutenção de medidas de contenção. Assim, a disponibilidade de testes de baixo custo e resultado rápido, que possam ser aplicados em massa e de forma contínua ainda são necessários. O domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína S de SARS-CoV-2 se mostrou um antígeno mínimo indutor de significativa resposta imune e, consequentemente, se tornou um alvo tanto para uso como antígeno em testes sorológicos como alvo de anticorpos em testes de captura de antígenos. Devido à similaridade entre o RBD de SARS-CoV- 2 com RBD de SARS-CoV-1, ambos foram incluídos como parte deste estudo, cujo objetivo é estabelecer ferramentas para a produção de antígenos e anticorpos recombinantes em conformação nativa, em linhagens estáveis de células HEK293. A expressão dos RBDs foi obtida com êxito utilizando o vetor pIRES2-EGFP, sendo que a fluorescência emitida pela eGFP serviu para monitoramento da eficiência de transfecção e seleção das células com maior nível de expressão. Para produção de fragmentos de anticorpos do tipo Fab (fragment-binding domain), compostos por duas cadeias polipeptídicas, foram feitas otimizações no vetor pcDNAmod para inserir a sequência codificadora da eGFP, para servir como molécula indicadora, seguida de uma deca-histidina para facilitar a posterior purificação. Além disso, foi construído um novo vetor, denominado pDEHA, com sítios de restrição em locais apropriados para co-expressão de proteínas diméricas e contendo sequências de integração genômica por recombinação no locus AAVS1, considerado seguro para seleção de linhagens com expressão estável. Os vetores pcDNAmod-eGFP e pDEHA se mostraram eficientes para expressão do Fab do anticorpo CR3022. Nestes vetores as proteínas recombinantes são secretadas, sendo facilmente purificadas a partir do sobrenadante da cultura celular utilizando cromatografia de afinidade a níquel imobilizado. A expressão das cadeias pesada e leve do Fab CR3022 em diferentes clones transformados com o vetor pcDNAmod-eGFP, parece não ocorrer de forma estequiométrica, confirmando as dificuldades inerentes à produção de proteínas hetero-oligoméricas. Análises do número de inserções no genoma e da taxa de transcrição utilizando PCR quantitativa não foram conclusivas, demandando mais análises para se compreender a origem da diferença de expressão das duas cadeias do Fab entre os clones. Os RBDs e o Fab CR3022 se mostraram eficientes em testes de interação in vitro. Os vetores de expressão e os procedimentos experimentais estabelecidos neste estudo podem contribuir para a produção de insumos para testes de diagnóstico da COVID-19, assim como podem servir para produção de outras proteínas diméricas em diferentes contextos e aplicações.

Abstract: The SARS-CoV-2 coronavirus is the etiologic agent of COVID-19, a respiratory disease that in end of 2019 started to spread quickly around the world. SARS-CoV-2 viral genome detection using quantitative RT-PCR is considered the gold standard method for detecting active infections. However, this technique has a higher cost and requires specialized laboratories and professionals for its implementation. Antigen capture methods have contributed to track active infections while vaccines and drugs have been effective in containing the pandemic. However, the number of cases and deaths is still high, and the continuous emergence of new variants requires the maintenance of containment measures. Thus, low cost and fast-response assays that can be applied in large scale and on a permanent basis are still needed. The receptor-binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 spike protein is a minimal antigen inducing a significant immune response and, consequently, has become a target both as an antigen in serological tests as well as for antibodies in antigen capture assays. Due to the similarity between the SARS-CoV-2 and SARSCoV- 1 RBD, both were included as part of this study, whose objective is to establish tools for production of recombinant antigens and antibodies in native conformation in stable HEK293 cell lines. Expression of the RBDs was successfully achieved using the pIRES2-EGFP vector. The fluorescence emitted by eGFP was used to monitor transfection efficiency and select the cells with the highest expression level. For production of Fab antibody fragments (fragment-binding domain), composed of two polypeptide chains, optimizations were made in the pcDNAmod vector to insert the eGFP coding sequence, to serve as an indicator molecule, followed by a decahistidine to facilitate their subsequent purification. In addition, a new vector, named pDEHA, was constructed with restriction sites located at appropriate sites for cloning two coding sequences for co-expression of dimeric proteins, and with flanking sequences for genomic integration by recombination at the AAVS1 locus, which is considered safe for selecting cells lines with stable expression. The pcDNAmodeGFP and pDEHA vectors were efficient for Fab CR3022 expression. In these vectors, the recombinant proteins are secreted, being easily purified from the cell culture supernatant by affinity chromatography on immobilized nickel columns. Expression of the heavy and light chains in different clones of cells transfected with the pcDNAmod-eGFP vector seems not to occur stoichiometrically, confirming the difficulties inherent to the production of hetero-oligomeric proteins. Analyzes of the number of insertions in the genome and the transcription rate using quantitative PCR were not conclusive, requiring further studies to understand the origin of the difference in expression of the two Fab chains between the clones. The recombinant RBD from SARS-CoV-1 and SARS-Cov-2 and the CR3022 Fab proved to be efficient in vitro interaction assays. The expression vectors and experimental procedures established in this study can contribute to the generation of reagents for COVID-19 diagnostic tests, and for the production dimeric proteins in future studies.