Citogenética comparativa do gênero Pipa (Anura, Pipidae) e estudo do DNA satelite PcP190 no genoma de anuros

Abstract

Resumo: O gênero Pipa é exclusivamente neotropical e atualmente agrupa sete espécies. A ausência de uma filogenia robusta é uma das grandes lacunas para os estudos evolutivos no gênero. Métodos clássicos da citogenética fornecem dados cariótipicos, além disso, DNAs repetitivos tem se mostrado promissores em estudos relacionados à evolução cromossômica. Dentre os satDNA isolados em anfíbios, o PcP190 se destaca por estar distribuído em diferentes espécies de anuros. Considerando que, apenas algumas espécies de Pipa foram cariotipadas, justifica-se o uso de técnicas de citogenética no estudo da evolução cariotípica do grupo. Além disso, a busca da sequência satDNA PcP190 utilizando bioinformática é uma ótima ferramenta para identificar essas sequências nos genomas disponíveis. Para a descrição cariotípica, foram utilizados métodos de coloração convencional, bandamento C e detecção da RON. Para detecção das sequências microssatélites em P. pipa, sete sondas de microsatelites e repetições teloméricas foram utilizadas no método de hibridização in situ fluorescente (FISH). Foi redescrito o cariótipo de P. parva com 2n=30, todos com morfologia telocêntrica e com blocos de heterocromatina localizados nas regiões centroméricas dos cromossomos, a RON foi detectada na região subterminal do par 2. Foi descrito pela primeira vez o cariótipo de P. arrabali com 2n=20 cromossomos. Pipa arrabali e P. carvalhoi (Zattera et al.,2019), compartilham mesmo número cromossômico e morfologia dos pares, sendo diferenciados pela posição da RON, localizada na região pericentromérica do 9q em P. arrabali e em P. carvalhoi na região subterminal desse mesmo braço, o que pode ter sido resultado de uma inversão paracêntrica. O mapeamento das repetições em P. pipa revelou sinais na região centromérica dos primeiros quatro pares dos cromossomos do cariótipo. A organização de algumas classes de DNAs repetitivos em P. pipa indica o potencial desse marcador no estudo da evolução cromossômica do gênero. Quanto ao mapeamento do satDNA PcP190 nos genomas dos anuros já sequenciados, foram utilizados dados de Sequence Read Archive (SRAS) e selecionadas sequências do PcP190 disponíveis na literatura. A região mais conservada foi utilizada como query nas buscas. 24 espécies de anuros foram mapeadas e para avaliar a distribuição do PcP190, reconstruímos um cladograma entre as espécies com genomas amostrados e espécies relatadas com esta sequência. Reportamos a presença de cópias de PcP190 em duas espécies da família Hylidae, e pela primeira vez, nas famílias Bufonidae e Dendrobatidae. Inferirmos que estas sequências surgiram por duplicação em um ancestral comum e a manutenção tem sido baseada em Concerted evolution e birth-and death. Uma região de 122 pb de PcP190 de diferentes espécies apresentou alta similaridade, hipotetizamos que isto pode ser devido a uma alta pressão seletiva, resultante de uma possível função genômica desta região. A variação do número de reads mapeados pode ser devido ao fato de espécies filogeneticamente relacionadas compartilharem uma biblioteca de DNAs repetitivos, onde a expansão de satDNA ocorre de maneira independente após seu processo de divergência. Nossos dados fornecem um modelo para verificar a presença de diferentes sequências nos genomas.

Abstract: The genus Pipa is exclusively neotropical and currently groups seven species. The absence of a robust phylogeny is one of the major gaps for evolutionary studies in the genre. Classic methods of cytogenetics provide karyotypic data, in addition, repetitive DNA has shown promise in studies related to chromosomal evolution. Among the satDNA isolated from amphibians, PcP190 stands out for being distributed in different anuran species. Considering that only some species of Pipa were karyotyped, the use of cytogenetic techniques in the study of the group's karyotype evolution is justified. In addition, the search for the PDP190 satDNA sequence using bioinformatics is a great tool to identify these sequences in the available genomes. For the karyotype description, conventional staining, C banding and NOR detection methods were used. To detect microsatellite sequences in P. pipa, seven microsatellite probes and telomeric repetitions were used in the fluorescent in situ hybridization (FISH) method. The P. parva karyotype was redescribed with 2n = 30, all with telocentric morphology and with heterochromatin blocks located in the centromeric regions of the chromosomes, NOR was detected in the subterminal region of pair 2. The P. arrabali karyotype was described for the first time. with 2n = 20 chromosomes. P.arrabali and P. carvalhoi (Zattera et al., 2019), share the same chromosomal number and morphology of the pairs, being differentiated by the position of NOR, located in the 9q pericentromeric region in P. arrabali and in P. carvalhoi in the subterminal region of that same arm, which may have been the result of a paracentric inversion. The mapping of the repeats in P. pipa revealed signs in the centromeric region of the first four pairs of the karyotype chromosomes. The organization of some classes of repetitive DNA in P. pipa, indicates the potential of this marker in the study of the chromosomal evolution of the genus. As for the mapping of the satDNA PcP190 in the genomes of the anurans already sequenced, data from the Sequence Read Archive (SRAS) were used and PcP190 sequences were available in the literature. The most conserved region was used as a query in searches. 24 anuran species were mapped and to assess the distribution of PcP190, we reconstructed a cladogram between species with sampled genomes and species reported with this sequence. We report the presence of copies of PcP190 in two species of the family Hylidae, and for the first time, in the families Bufonidae and Dendrobatidae. We infer that these sequences appeared by duplication in a common ancestor and the maintenance has been based on Concerted evolution and birth-and death. A 122 bp region of PcP190 from different species showed high similarity, we hypothesize that this may be due to a high selective pressure, resulting from a possible genomic function of this region. The variation in the number of reads mapped may be due to the fact that phylogenetically related species share a library of repetitive DNAs, where the expansion of satDNA occurs independently after its divergence process. Our data provide a model to verify the presence of different sequences in the genomes.