Avaliação da atividade de RhoA ante a interação proteica STI1-Rnd1

Abstract

Resumo: As proteínas Rho constituem uma família de pequenas GTPases monoméricas que são reguladoras chave do citoesqueleto. Rho GTPases clássicas como RhoA atuam como switches moleculares, alternando entre um estado inativo de ligação ao difosfato de guanosina (GDP) e um estado ativo, de ligação ao trifosfato de guanosina (GTP). RhoA é uma proteína ubiquamente expressa e sua atividade tem sido diretamente associada à uma ampla gama de processos biológicos. Já Rnd1 é uma Rho GTPase atípica por ser constitutivamente ativa, e tem sido relacionada à regulação da atividade de RhoA. É bem estabelecido na literatura que Rnd1 reduz a contratilidade da actomiosina através da inibição de RhoA, via ativação da proteína ativadora de GTPase (GAP) p190RhoGAP. Rnd1 pode ligar-se a diferentes proteínas, sendo uma destas a proteína STI1. STI1 é reconhecida como uma co-chaperona que age em conjunto com as chaperonas Hsp70 e Hsp90, promovendo o dobramento correto de proteínas – sendo essencial à manutenção da proteostase celular. Nosso grupo de pesquisa demonstrou anteriormente a interação específica in vitro entre STI1-Rnd1, sendo que tal interação inibe o colapso do cone de crescimento em células COS-7, e aumenta a extensão de neuritos em células PC-12. Assim, o presente trabalho teve por objetivo elucidar se tal interação proteica é capaz de modular a atividade de RhoA através da via Rnd1-p190RhoGAP-RhoA. A transfecção com polietilenoimina (PEI) das construções utilizadas foi padronizada em células HEK-293T. Para realizar ensaios pulldown, as proteínas de fusão GST-RBD e GST-RhoAG14V foram expressas em bactéria, ligadas à resina Glutationa Sepharose-4B e foi quantificado quanto de cada proteína fora ligado. Ensaios pulldown de RhoA-GTP foram realizados utilizando a quimera GST-RBD como bait. Para confirmar a especificidade de ligação à forma ativa de RhoA, ensaios de ativação de RhoA com Fator de Crescimento Epidermal (EGF) foram padronizados em células HeLa. Por fim, a atividade de RhoA foi avaliada via ensaios pulldown em extratos de células HeLa co-transfectadas com RhoA, STI1 e Rnd1. A co-transfecção teve baixa eficiência e não foi possível determinar a influência da interação STI1-Rnd1 sobre a atividade de RhoA. No entanto, a porção de RhoA-GTP parece ser ligeiramente maior no grupo experimental expressando STI1 e menor em células expressando Rnd1 (quando comparados ao controle). O entendimento de tal via metabólica demonstra-se importante pela perspectiva da relação das proteínas estudadas com a oncogênese e a migração tumoral. Assim, espera-se que os resultados a obtidos possam colaborar na construção do conhecimento acerca da regulação do citoesqueleto

Abstract: Rho proteins constitute a family of monomeric small GTPases that are key regulators of the cytoskeleton. Classical Rho GTPases such as RhoA act as molecular switches, alternating between an inactive guanosine diphosphate (GDP)-binding state and an active guanosine triphosphate (GTP)-binding state. RhoA is a ubiquitously expressed protein and its activity has been directly associated with a wide range of biological processes. Rnd1 is an atypical Rho GTPase as it is constitutively active, and has been related to the regulation of RhoA activity. It is well established in the literature that Rnd1 reduces actomyosin contractility through inhibition of RhoA, via activation of the GTPase-activating protein (GAP) p190RhoGAP. Rnd1 can bind to different proteins, one of which is the STI1 protein. STI1 is recognized as a co-chaperone that acts in conjunction with the Hsp70 and Hsp90 chaperones, promoting the correct folding of proteins – being essential for the maintenance of cellular proteostasis. Our research group previously demonstrated the specific in vitro interaction between STI1 Rnd1, with this interaction inhibiting growth cone collapse in COS-7 cells, and increasing neurite extension in PC-12 cells. Thus, the present work aimed to elucidate whether such protein interaction is capable of modulating RhoA activity through the Rnd1-p190RhoGAP-RhoA pathway. Polyethyleneimine (PEI) transfection of the used constructs was standardized in HEK-293T cells. To perform pulldown assays, GST RBD and GST-RhoAG14V fusion proteins were expressed in bacteria, bound to Glutathione Sepharose-4B resin and how much of each protein was bound was quantified. RhoA-GTP pulldown assays were performed using the GST-RBD chimera as bait. To confirm the specific binding to the active form of RhoA, RhoA activation assays with Epidermal Growth Factor (EGF) were standardized in HeLa cells. Finally, RhoA activity was assessed via pulldown assays in extracts from HeLa cells co transfected with RhoA, STI1 and Rnd1. Co-transfection had low efficiency and it was not possible to determine the influence of the STI1-Rnd1 interaction on RhoA activity. However, the portion of RhoA-GTP seems to be slightly bigger in the experimental group expressing STI1 and smaller in cells expressing Rnd1 (when compared to the control). Understanding this metabolic pathway is important from the perspective of the relationship between the studied proteins with oncogenesis and tumor migration. Thus, it is expected that the results obtained will contribute to the construction of knowledge about the regulation of the cytoskeleton